分子克隆实验——无缝克隆

虾米

无缝克隆的原理：

在载体末端和引物末端应具有15-25个同源碱基（同源臂）。通过T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶，三种酶同时发挥功能，从而达到单片段或多片段与载体连接的技术。

T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，

形成粘性末端；DNA聚合酶：填补缺口；

DNA连接酶：两条DNA 单链黏合起来。

无缝克隆的特点

传统分子克隆和无缝克隆对比：

• 单次插入片段：传统分子克隆一轮只能插入一个片段；无缝克隆单个至多个（≤5）。
• 受限于酶切位点：传统分子克隆是；无缝克隆不是。
• 引入多余序列：传统分子克隆是；无缝克隆不是。
• 流程&操作时间：传统分子克隆流程繁琐，时间长。
• 无缝克隆流程简单，时间短。
• 克隆效率：传统分子克隆较低；无缝克隆单片段≥95%。
  
  

实验流程

1.载体制备

载体的线性化：酶切（单酶切、双酶切）或反向 PCR 扩增。

① 酶切制备

使用限制性内切酶进行载体线性化时，推荐使用双酶切方法进行，其次是单酶切。

注意:

1：经双酶切进行线性化的载体无需去磷酸化，经单酶切则需要去磷酸化；

2：酶切完成后，应将快速内切酶失活或将目的产物进行纯化后再用于重组反应。

② 反向 PCR 扩增制备

载体末端引物设计：

反向 PCR 扩增制备线性化载体需要使用的引物；

为了减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增，推荐使用预线性化的质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注意：以环状质粒为模板时，PCR 产物需要使用 DpnI 等甲基化敏感型限制性内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。

2.插入片段制备

引物设计原则：

通常使用PCR扩增的方法来获得目的片段，PCR 引物的5' 端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25nt（推荐 18 nt）序列 , 以保证扩增产物的5' 端和3' 端分别与相邻片段形成重叠序列。目的片段 PCR 引物包括：载体与插入片段连接处引物、插入片段与片段连接处引物。

插入片段正向扩增引物：

5' —上游载体末端正向同源序列+酶切位点（可选）+ 基因特异性正向扩增序列—3’

插入片段反向扩增引物：

3‘ —基因特异性反向扩增序列 + 酶切位点（可选）+ 下游载体末端反向同源序列—5’

载体与插入片段、插入片段与片段连接处引物、载体反向扩增引物设计

引物设计工具

3.无缝克隆

1、体系配制；

a. 最适载体用量（ng） = 0.02 × 载体碱基对数，即 0.03 pmol（单片段、多片段适用）；

b. 最适片段用量（ng）= 0.04 × 片段碱基对数（单片段）；最适片段用量（ng）= 0.02 × 片段碱基对数（多片段）。

注1：单片段重组反应，若单个插入片段的长度大于载体，则应将载体与插入片段的计算公式互换；

注2：单片段重组反应，若单个插入片段的长度小于200bp，则插入片段应使用 5 倍的用量；

注3：多片段重组反应，各个插入片段的用量应不少于10ng，使用上述公式计算最适使用量低于此值时， 直接使用 10ng；

注4：若按上述公式计算出的线性化载体用量低于50ng 或高于200ng，建议按50ng或 200ng用量使用；

注5：线性化载体过长，插入片段过长或片段数过多，克隆阳性率均会降低。

2、体系反应；

1、配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀各组分，避免产生气泡，切勿涡旋；

2、将反应体系置于50℃，反应5~60min。

3、将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于-20℃

注1：推荐使用PCR仪等温控精准的仪器进行反应，反应时间不足或太长克隆效率均会降低；

注2：插入1~2个片段时，推荐反应时间为5~1 min；插入3~5个片段时，推荐反应时间为15~30min；

注3：当载体骨架在10kb以上或插入片段总长在4kb以上时，推荐延长反应时间至30~60min；

注4：建议在50℃反应完成后进行瞬时离心，将反应液收集至管底。

注5：-20℃ 储存的重组产物，建议1周内使用完毕。

4.转化

① 将克隆用的化学感受态细胞置于冰上解冻；

② 取 5~10μl重组产物反应液，加入到100μl感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置30 min；

③ 42℃热激 45~60 sec，冰浴5min；

④ 加500μlSOC或LB培养基，37℃振荡培养40~60min（200rpm）；

⑤ 将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。

注 1：推荐使用转化效率>108CFU/μg的感受态细胞；

注 2：菌落数取决于PCR产物与线性化载体的数量和纯度。

5.克隆筛选

① 菌落 PCR 法：挑取单菌落至10μlddH2O 中混匀，95℃裂解 10 min 后，取1μl裂解液作为模板，使用合适的正、反向引物进行菌落PCR鉴定。

注：菌落PCR时建议至少使用一条通用引物，避免假阳性结果。

② 酶切法：挑取单菌落接种至合适抗性的液体培养基中过夜培养后，提取质粒进行酶切鉴定。

③ 测序鉴定：使用载体的通用引物测序，进行序列分析。

实验注意事项

1. 单次完成多个插入片段或者重组质粒的长度较长时，推荐使用高效率感受态细胞进行重组产物转化；

2. 若使用未纯化的PCR扩增产物进行重组反应时，加样体积不应超过2μl（总反应体积的20%）；

3. 以质粒为模板进行插入片段PCR扩增时，若后续使用 DpnI 消化处理，应在反应完成后失活 DpnI，以免降解重组载体。