关于WB，你不得不注意的小细节

生物科研实验室

1. 关于样本制备

问题描述：

1）明明已经多算了上样量，可上样时发现样本还是不够？

2）同时提取的蛋白，为啥别人的没降解偏偏你的降解了？

3）同样的变性条件，你的样本却糊成一团团絮状物，吸不上来？

4）你有了解你的样本吗？

问题分析及解决方案：

1）蛋白样品变性结束请勿立即开盖，因为立即开盖随着蒸汽的蒸发会造成样品的损失，导至上样量不足。正确的操作是在冰上冷却片刻，离心后再开盖；

2）提取蛋白时整个流程一定要在冰上进行，维持低温环境以保证蛋白活性，与此同时，在提取蛋白时要加入一定量的蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解；蛋白提取完成后，最好分装保存于-80℃，避免反复冻融（反复冻融极易产生冰晶，会破坏蛋白结构）；

建议每次上样前即便是已经变性保存的蛋白也最好再次变性处理，以保证上样前蛋白完全线性化；

3）变性后样品凝结成团的因素颇多，如：蛋白浓度过高、Loading Buffer不够等等，此时可以适当的调整变性时间和温度，或者补充Loading Buffer，但若出现明显的蛋白和水分层的现象，蛋白凝固不可再用于WB；

4）样本的制备直接决定结果的好坏，所以最好充分了解自己的样本，是细胞还是组织？采用何种方式处理？

尤其要注意心肝脾肺肾等含血细胞较多的组织，一定要去除红细胞的影响（可以买专门的去红细胞试剂盒，也可以将组织按PBS：蛋白酶抑制剂=100:1的比例进行洗涤，重复多次，必要时也可辅以7500g，离心3-5min进行处理）。



2. 关于制胶与配液
问题描述：
1）总是漏胶怎么办？制完的胶短期内如何保存？

2）什么时候拔梳子？拔梳子总是造成加样孔碎裂或歪斜？

3）配制电泳液、转膜液、封闭液要注意什么？

4）电泳液、转膜液配制一次可重复使用吗？

问题分析及解决方案：

1）如若发现经常性漏胶，可以先注入纯水进行检漏，若不漏胶，弃去纯水，用吸水纸吸干水分即可开始制胶；制胶完毕后，可以将胶置于装有电泳液的密封袋里放于4℃冰箱保存；

2）制胶完毕后最好不要立马拔梳子，可以在电泳槽里组装完毕加入电泳液后再拔梳子，借助电泳液的润滑作用拔出梳子，否则在干燥的状态下有可能弄碎加样孔，与此同时也要注意用于保存胶的电泳液不可过多，仅仅起到保湿作用即可，过多会因为长时间的浸泡导至胶变脆，加样孔间的柱子失去支撑力，从而出现东倒西歪的现象；

3）准确称量与充分溶解是配液的关键所在，尤其是电泳液的配制，若配制不当引起电压电流的波动则很容易形成波浪状条带；电泳液、转膜液最好提前配制，并置于4℃冰箱预冷，尤其是转膜液，温度过高会造成条带变形；封闭液若采用脱脂奶粉，一定要充分溶解（可以涡旋混匀后再置于摇床上混匀），条带显影时大的黑色斑点通常是脱脂奶粉溶解不完全导至的，另外脱脂牛奶要以防长时间放置引起变质，倘若配制较早，最好放于4℃冰箱保存；

4）一般而言电泳液、转膜液可以重复使用，但也要视电压电流而定。尤其是转膜液，虽大部分人采用恒流转膜，但也要注意电压的变化，若二次使用电压比较低就要适当延长转膜时间或者重新配制转膜液，否则会造成蛋白转不上去，尤其是大分子蛋白；如若自己配制的电泳液也可使用1-2次，用成品的电泳缓冲液粉配制的电泳液性能稳定，重复使用2-3次完全没问题。