点亮模型第1期 | 手把手带你了解真菌性角膜炎

虾米

你点亮模型，我来讲（做）”昨天发出后，在后台收到多名小主们的回复，按照先后顺序，今天小助手先写“真菌性角膜炎模型”~

真菌性角膜炎（fungal keratitis，FK）是一种高致盲率的感染性角膜病，严重者甚至丧失眼球。我国是个农业大国，真菌性角膜炎的发病率长期居高不下，近十年来，真菌性角膜炎的发病率在我国明显升高，主要与广泛应用广谱抗菌素及皮质类固醇激素，或长期配戴角膜接触镜和免疫抑制剂的使用有关。但是由于目前致病真菌繁多、病因复杂，对角膜真菌感染的发病机制的基础研究很局限，没有肯定结论，而且临床上缺乏低毒高效的抗真菌药物，所以真菌性角膜炎的治疗成为临床上相当棘手的问题。目前，缺乏理想的模拟人角膜真菌感染的动物模型阻碍了真菌性角膜炎基础研究的发展。

实验动物的选择

常见真菌研究中使用的动物多为小动物，如小鼠、豚鼠、地鼠、兔、鸟、犬和猫等。小鼠和豚鼠能满足绝大多数真菌动物接种的需要，而小鼠是真菌病动物模型中最常用的一种动物。国外有学者应用远交系NIH Swiss小鼠和近交系BALB／c小鼠成功制作真菌性角膜炎的动物模型，用于角膜真菌感染的临床、微生物学、组织病理学、和分子方面的研究；但小鼠的角膜很小，进行手术操作时困难，感染后可取材的标本少，而且不利于真菌感染大体形态学的观察。所以大部分学者在进行眼部真菌感染研究中，最常应用的实验动物是兔。兔角膜较人角膜大，容易对其进行手术操作和局部观察，可以获得较多的实验标本。常用的有新西兰大白兔及荷兰带纹兔。

真菌菌种的选择

真菌主要分为丝状菌（如镰刀菌属、曲霉菌属、青霉菌属及暗色真菌等）和酵母菌（主要为念珠菌属）两大类；迄今全球发现70余种真菌可引起角膜感染，其主要致病菌种在不同地区差别较大，且相对集中，以丝状菌居多。发达国家及气候较寒冷地区（如美国北部和英国）的主要致病菌种为白色念珠菌；发展中国家及气候温暖或炎热地区（如美国南部、印度、尼泊尔等）主要为镰刀菌和曲霉菌。综合我国广东、河南、河北及山东地区调查结果显示：真菌性角膜炎主要致病菌种为镰刀菌和曲霉菌，大部分地区镰刀菌占首位‚其次为曲霉菌。现在国内外文献报道的真菌性角膜炎研究中，也多数集中于镰刀菌属，曲霉菌属，白色念珠菌，少见暗色真菌。为保证实验结果的可重复性和可靠性，进行动物模型制作时‚尽可能选用权威微生物种保存机构（如 American Tissue Culture Collection，ATCC；中国科学院微生物研究所等）保存的标准菌株，而且最佳者为分离自临床真菌性角膜炎患者的标本。

操作方法

1、真菌菌液的配制菌液浓度从106～1010 CFU／ml不等，至今没有一个统一的浓度标准。随着菌液浓度的增加‚角膜的感染成功率提高，而一次接种达到106CFU就足以使所有角膜感染真菌。但是一次接种的菌液量很有限（0.005ml～0.1ml），这就需要配制的真菌菌液达到很高的浓度（至少达到107CFU／ml）。2、角膜接种的方法（1）角膜基质注射法使用带28或30号针头的0.5ml胰岛素注射器，将0.05ml预制真菌菌液注入动物角膜中央基质层内，形成一定的容积，注射深度约角膜基质的1／3深度，主要用于真菌性角膜炎药物疗效和诊断方法的研究。为了提高真菌的感染率和维持角膜的持续感染，部分研究在接种真菌之前一天，将实验动物眼球结膜下注射一定量的皮质类固醇激素（如12mg氟羟强的松龙），但是这种动物模型与真菌性角膜炎临床病例自表面感染的自然病程很不相同，皮质类固醇激素可以改变正常的真菌性角膜炎的病程，而且基质内注射在一定程度上破坏了角膜的正常结构，所以不适合用以研究真菌感染角膜的发病机制、发生发展过程及感染组织病理学的研究。（2）角膜接触镜法接种真菌前，完整刮除兔角膜中央直径7mm范围的上皮，然后覆盖上软性角膜接触镜，在接触镜与角膜层间注入0.1ml白色念珠菌菌液（浓度1010CFU／ml），再行暂时性睑裂缝合术，24小时后打开睑裂并去除角膜接触镜，此方法近似人角膜感染的病程，即真菌孢子沉着于去除上皮的角膜表面，生长并产生菌丝侵入角膜基质。缺点：但是经过皮质类固醇激素处理的动物，其角膜感染重，真菌菌丝浸润范围深而广，而且与使用皮质类固醇激素的剂量成正比。虽然文献报道此法建立的动物模型相对模拟临床上人角膜真菌感染的情况，感染成功率较高，可不依赖皮质类固醇激素，现在已经应用于念珠菌性角膜炎的组织病理学研究，但是实验中所应用的真菌菌液浓度很高，达到2×109或1010CFU／ml，这一浓度几乎是基质注射法所采用的数十甚至上百倍，据真菌感染机体发病机制的研究，其发病除与致病菌种、真菌毒力、机体免疫状态有关，还可能与真菌数量有关，过高浓度的真菌菌液是否引起真菌性角膜炎病变过重，其病程是否存在差别，目前尚无明确的研究结果，所以此方法并不完全近似临床真菌感染角膜的实际情况；而且其仅研究了白色念珠菌，对于发展中国家中最常见的镰刀菌属，缺乏相关研究。（3）角膜表面镜片术法刮除角膜中央部分上皮（约6mm）后，将预制的全厚异体角膜植片（甘油冷冻保存）缝在动物角膜表面，层间注入一定量的真菌菌液，接种后24小时移去角膜植片。优缺点：此方法不依赖皮质类固醇激素，所应用的真菌菌液浓度相对较低，角膜植片以缝线固定，其层间空间稳固，保证了真菌成分与创伤角膜表面的充分接触，创造了适合真菌生存繁殖的良好环境，其感染成功率高，近100％，可重复性较好；但是此方法操作过程相对复杂，对实验者的手术技术水平有一定的要求。

感染成功后的鉴定

真菌培养检查是最基本的手段，准确率较高而且较简单，也是真菌鉴定的金标准。对感染组织进行真菌培养，常规鉴定使用的培养基为沙氏葡萄糖琼脂（SDA）斜面培养基，加0.05％氯霉素，经过至少72小时后待培养基表面有真菌菌落生长后观察并鉴定菌种，霉菌常用形态学鉴定，而酵母常以形态和生理结合方法鉴定。感染角膜取活体组织进行组织病理学检查也是真菌菌种鉴定的重要方法，但不够准确特异，需进一步借助更为特异的方法来鉴定。免疫组织化学方法可通过检测真菌特异性抗原来诊断组织中的真菌病原体，除特异性外，免疫组织化学技术比组织化学方法更为敏感，是仅次于培养法这一金标准的最特异的诊断手段。

感染后角膜病变的观测和量化

目前常用裂隙灯显微镜观察角膜感染灶并行大体及裂隙照相，记录角膜病灶形态、感染范围、深度及前房反应情况进行临床评分，评分标准可参照 O’DAY改进方法。重点为根据角膜感染灶范围分为0～4共5级；根据角膜病变深度分为0～4共5级；根据前房反应程度分为0～4共5级；依据以上三个标准对每一眼进行临床评分，综合三个分数为该眼总分，将角膜感染量化。

总结

医学科学的严谨性要求在真菌性角膜炎的基础研究中，需要建立一种成功率高、病程的发生发展模拟人角膜感染的过程、统一采用的动物模型制作方法，保证动物实验研究的成果客观、可信、可重复，服务于临床对真菌性角膜炎的防治，降低此种疾病的致盲率，从而推动眼科感染性角膜病科学研究的进步，这需要广大医学工作者不懈努力，不断尝试摸索实现这一目标。