未来诊断的新星：无细胞蛋白表达技术

Protein生物技术

诊断是公共卫生的重要组成部分，解决任何疾病的一个关键步骤是确定它是否存在。诊断开发主要有两方面目标，一方面提高临床性能，如提高定量的灵敏度、特异性和准确性，另一方面是改进分析特性，如降低成本、提高可移植性、简化工作流程、缩短得到结果的时间以及适应污染物的能力。随着合成生物学的发展，合成生物设备包括全细胞活性检测、工程化无细胞核酸传感器以及利用天然疾病生物学和重建酶功能的组合，已成功应用于非传染性疾病(如癌症和冠状动脉疾病)、传染性疾病(如埃博拉、寨卡、肺结核、疟疾、HIV和SARS-CoV-2等)以及公共卫生的其他方面(如常规血液分析物定量)。

图1：基于合成生物学的无细胞诊断

然而，世界上大部分地区严重缺乏诊断的基础设施。在世界卫生组织对三大洲十个国家进行的一项研究中，只有1%的卫生中心和诊所被认为具备基本诊断测试的能力。虽然合成生物学创建了基于合成基因网络的新型诊断方法，但绝大多数情况下仅限于实验室使用，并且需要昂贵设备和材料。

近年来，无细胞表达系统的发展使得工程RNA元件作为多功能诊断工具成为可能。无细胞表达系统包含基因表达所需的所有组分，因为活细胞中的操作会引起过度毒性和其他有害问题，无细胞系统也一直被用来研究基本的生化过程。而实验室之外部署合成基因回路(通过转录和转录后调控连接的基因工程网络)的重要进展也证明了将冷冻干燥处理的无细胞表达体系包埋在多孔基质(如纸)中，即使是在室温下储存，仍能在很大程度上保持其功能至少1年。合成基因回路可以嵌入一张纸中，实现在室温下的储存或运输，并在施用样品后通过再度水化重新激活。这几乎可以应用到任何设计中，包括抗生素的无细胞测试、重金属、镇静药物和生物活性小分子。

图2：基于纸张的合成基因网络

一种称为“Toehold Switch”的工程化的RNA调控因子特别适合用作特定核酸的生物医学诊断。这些“Toehold Switch”可与无细胞表达系统结合使用，创建高度便携的纸质核酸诊断。通过将等温核酸扩增、模块化“Toehold Switch”以及在纸上可稳定表达的无细胞系统进行组合提供一个适应性强、灵敏、稳定的诊断平台，能够在护理点检测特定核酸，每次检测的总成本仅为0.10–1.00美元。并且因为“Toehold Switch”的输出可以是任何蛋白质，所以几乎有无限的多路复用能力。该系统很容易适应荧光、生物发光、比色和生物电输出，并可为多输入逻辑构建复杂的基因网络。而且无细胞表达系统本身的特点使它能够表达抗感染剂(如纳米抗体或细菌溶素)，目前用于寨卡病毒诊断的纸质“Toehold Switch”正在北美和南美五个国家的地点进行合作研究，迄今已处理近300个临床样本。

近年来，靶向细胞内蛋白质的抗体在开发各种疾病的新型治疗干预措施方面具有很大的应用前景，特别是可以穿过细胞膜的抗体，其在控制与疾病相关的细胞内蛋白质-蛋白质相互作用方面具有潜在的应用价值。鉴于大量的胞质蛋白和复杂的相互作用可能与疾病发展有关，发现靶向细胞内蛋白的抗体需要对候选抗体进行反复的表达和评估。但是，目前基于细胞的表达方法不能提供足够的产能来生产和测定胞质溶胶穿透抗体，而无细胞蛋白质合成系统可以通过胞质溶胶渗透测定为生产功能性抗体提供最佳条件。因此无细胞合成是生产和检测细胞穿透抗体的有效选择。与大肠杆菌生产相比，具有较小的反应体积、最小的实验室设置和更具功能的抗体高速生成，证明了使用无细胞蛋白质合成作为开发细胞穿透抗体的有利方法的合理性。

无细胞表达体系在临床诊断中具有广泛的应用前景，无论是肿瘤标志物还是其他疾病所涉及的标志物，无细胞表达体系都能够实时合成出特定的蛋白质，通过对其表达水平的检测，实现疾病的早期检测和定量分析。这对于提高疾病诊断的准确性和效率非常重要。并且无细胞表达体系能够避免细胞污染等问题，在表达效率和功能调控方面也更加灵活。这些优势使得无细胞表达体系在临床诊断中更具可靠性和稳定性。

作为一种新兴的技术，无细胞表达体系正在临床诊断领域崭露头角。它的简便性、高效性和稳定性给临床诊断带来了许多新的可能。其在合成生物学中的使用也说明了学术界和工业界之间的合作正在加快技术创新和工业应用的步伐。例如，在2017年首次被提出基于CRISPR的旁系切割，让该研究团队在1年内创建了两家生物技术公司，总资本为124.2亿美元，到2020年，获得FDA批准了两种SARS-CoV-2诊断方法。

此外，针对新发现的SARS-CoV-2病毒也开发了多种功能性疫苗，在临床试验中进行了测试，并获得了紧急批准，并在10个月内进行了部署。相信在不断的研究和优化下，无细胞表达体系必将为临床诊断带来更多的创新，为人们的健康事业做出巨大的贡献。

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