国自然专家 | 一分钟了解线粒体自噬

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作为所有真核细胞的能量中枢，线粒体功能正常是维持细胞稳态的关键。一旦细胞和组织中ROS（活性氧）过度积累，则会导至线粒体损伤，引发线粒体DNA受损、膜电位改变、氧化蛋白活性改变，最终破坏细胞代谢稳态并导至细胞死亡。因此为了维持稳态平衡，细胞进化出了一种有效的线粒体质量控制手段—线粒体自噬（Mitophagy）。

一、什么是线粒体自噬？

在活性氧(ROS)胁迫、营养缺乏、细胞衰老等外界刺激的作用下，会导至线粒体DNA(mtDNA)突变逐渐累积，还会使细胞内线粒体膜电位降低和去极化损伤。为了维持线粒体和细胞稳态，防止受损线粒体损伤细胞，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成溶酶体的降解，这个过程称为线粒体自噬(mitophagy)。简言之，线粒体自噬是一种通过特异性清除细胞质中功能失调的线粒体，从而维持线粒体功能的完整性和细胞稳态的选择性自噬。

（DOI: 10.7150/thno.79876）

根据线粒体自噬过程的特征, 可将其分为4个关键步骤：

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前期线粒体受损后发生通透性转变，导至线粒体去极化，失去膜电位，诱导线粒体自噬相关蛋白活化；

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早期自噬体包裹受损线粒体，形成线粒体自噬体；

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中期线粒体自噬体与溶酶体融合后形成成熟的线粒体自噬溶酶体；

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溶酶体酸性水解酶流入自噬体降解线粒体，营养物质得以循环再利用。

二、线粒体自噬的分子机制

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泛素依赖途径（Ubiquitin-dependent pathways）

泛素依赖途径的关键蛋白是PINK1和Parkin，因此也被称为PINK1–Parkin介导的线粒体自噬途径（PINK1–Parkin mediated mitophagy）。PINK1是一种位于去极化线粒体上的丝氨酸/苏氨酸激酶，而Parkin是一种E3泛素连接酶，可催化泛素转移到线粒体底物。

当线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP,Am) 受损时，PINK1 进入线粒体内膜的途径受阻导至 PINK1 在线粒体外膜的胞质面上稳定聚集。同时，这会募集并激活 Parkin，Parkin 蛋白酶的空间构象发生改变，转化为活化的 E3 泛素连接酶，然后泛素化线粒体上的蛋白质。PINK1 与Parkin 相互作用，共同调控线粒体自噬过程以维持线粒体质量。

此外，除了 PINK1-Parkin 通路之外，还有非 Parkin 依赖性的泛素依赖性通路。也就是说，PINK1还可以通过泛素磷酸化直接招募自受体蛋白(如 NIX、BNIP3 和 FUNDC1)到线粒体，受体蛋白募集 LC3，这使得自噬体能够吞噬线粒体。

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非泛素依赖途径（Ub-independent pathways）

非泛素依赖的线粒体自噬是由线粒体自噬受体（Mitophagy Receptors）来主导，这与泛素依赖途径之间存在明显差异。

泛素依赖途径线粒体自噬的一个核心机制是磷酸化泛素的产生；而线粒体自噬受体如NIX、BNIP3和FUNDC1等都包含一个保守的LC3结合域（LC3-interaction region，LIR），他们可以通过LIR基序直接与自噬相关蛋白（ATGs，如LC3）结合，启动自噬。

在哺乳动物中，这些受体主要包括 Nip3 样蛋白 X (Nip3-like protein X,NIX) 受体bcl2 相互作用蛋白 3 (BCL2-interacting protein 3,BNIP3) 受体、FUN14 结构域包含 1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1) 受体。

三、下面给大家分享一下线粒体自噬相关蛋白的检测方法

1、PINK1

PINK1由581aa组成，分子量约为63kDa。前面也讲到在稳态条件下线粒体上的PINK1会被切割水解，根据切割位点不同，会产生~52kDa或~48kDa截短形式。因此在正常生理条件下，PINK1全长形式存在较少。

PINK1蛋白的结构及剪接机制

在自噬诱导条件（CCCP处理）下，PINK1不能易位到线粒体内膜，阻断了蛋白切割过程。PINK1与线粒体外膜复合物（TOM）相互作用并稳定在线粒体外膜上。FL-PINK1在线粒体膜上积累，在WB实验中可看到条带增强。

PINK1蛋白的WB检测

注：CCCP是一种强效的线粒体氧化磷酸化解偶联剂，促使线粒体内膜对H+产生通透性，导至线粒体内膜两侧的膜电位丧失，诱导线粒体自噬。

2、BNIP3L/NIX和BNIP3

BNIP3L首先被发现为一种促凋亡的BCL2家族蛋白，可诱导细胞凋亡或坏死；不过最近的研究发现，BNIP3L可通过自噬促进网织红细胞的线粒体消除。

BNIP3的免疫荧光检测