干货分享 | 流式细胞术最全实验流程

生物科研实验室

流式细胞仪通常配有多个激光器，它们产生特定波长的光。由于每种荧光染料发出的光通常结合长通或短通滤光片被带通滤光片过滤，故流式细胞仪只检测特定波长范围内的荧光。在选择荧光染料时，请确认仪器带有能够激发目标荧光染料的激光器，以及能够检测该染料发射光的滤光片组合。

抗体选择/多色组合设计


一般来说，在同一样品上使用的荧光染料越多，从该样品中收集到的信息也越多。在单个样品上组合使用多种荧光染料时，设计需要遵循以下几点基本建议：


<10种颜色

1.抗原密度*应该与荧光染料亮度相匹配

◆最重要的是，低密度或难以检测的标志物应该与明亮的荧光染料配对。

◆高密度的标志物与中等或暗淡的荧光染料配对。

2.选择跨通道的荧光染料，最大限度减少荧光溢漏。

3.测试！


>10种颜色

1.让低表达丰度的标志物与明亮的荧光染料相匹配。

2.最大限度减少溢漏，特别是低表达抗原。

3.利用溢漏扩散矩阵(SSM)**来确定哪些通道的分辨率可能受到影响。

4.对于相互排斥的抗原(同一类细胞上不会同时表达的抗原),将次优的荧光染料组合留给它们。

5.测试！


*什么是抗原密度？

抗原密度指的是蛋白质在细胞内或细胞上的表达水平(详见下图)，这是在多色设计时的一个重要考虑因素。为了确保能被检测到，低水平表达的抗原、细胞内抗原或连续表达（非诱导）的抗原应当与最明亮的荧光染料配对。抗原密度和预期表达模式可在网上或文献中查到。

**溢漏与溢漏扩散之间有何差异？

溢漏是指荧光染料的信号“溢出”到其他的检测器。这是由荧光染料发射和仪器光学设置产生的问题。
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溢漏扩散是因多个荧光染料溢出到每个检测器而导至的测量误差，这引起某些通道的分辨率降低。



1随着实验中荧光染料的数量不断增加，溢漏扩散变得影响更大，并且荧光越亮，扩散越大。通过建立溢漏扩散矩阵（SSM）可识别哪些通道可能出现溢漏扩散的问题。一般来说应避免暗淡信号受到这种现象的影响。

实验对照


流式细胞术的对照可分为五大类2：


仪器对照

仪器对照是通过追踪激光器、检测器和流体性能，从而确认仪器是否正常工作3。一般来说，这些对照涉及到仪器制造商提供或出售的校准颗粒或荧光微球。这些质量控制微球应在仪器运行的每一天使用。


补偿对照

当荧光染料之间的发射光谱重叠时，这些信号会扩散到多个通道。校正溢漏的过程被称为补偿4。补偿可确保检测器只计算该通道特定的荧光发射光。补偿实验需要每种荧光染料的单染样品（每个样品只染一种染料）。
①补偿荧光染料必须与实验荧光染料完全匹配。

◆同一通道内的荧光染料仍具有不同的发射光谱，并且不可互换。例如，FITC不能作为GFP的补偿对照。

◆由于复合染料的差异，实验中的复合染料标记抗体应当与补偿计算所用的抗体完全相同（来自同一支抗体）。使用相同的复合荧光染料偶联不同的抗体、甚至仅是不同批次抗体，都可能会导至计算结果不准确。

②补对照的亮度必须与实验样品相同或更高。

③对于任何对照，阴性和阳性群体的自发荧光必须相同。最好的做法是单独为每个通道的阳性和阴性群设门，避免使用通用的阴性对照。

④收集足够多的事件！补偿依赖于荧光强度中位值的准确计算，如果事件太少，将无法准确计算。收集数量应多于5000个。



*抗体捕获微球与抗体重链结合,因此与生物样品不同,不需要特异性抗原识别。作为实用性补偿试剂,这些微球可提高补偿的一致性,特别适用于:

●阳性群体染色暗淡或稀少。补偿微球具有强烈的荧光信号，使得补偿对照的亮度与实 验样品相同或更高

●处理多种荧光染料