基于液滴微流控的细胞凝胶微球研究

微流控芯片

摘要：液滴微流控技术在微纳米尺度上对多种流体的流动进行精确控制，从而能够以高通量的方式生成结构可调和成分可控的微纳米液滴。通过结合合适的水凝胶材料和制造方法，可以将单个或多个细胞高效地封装进水凝胶中，制备细胞凝胶微球。细胞凝胶微球可以为细胞的增殖、分化等提供一个三维的、相对独立可控的微环境，在三维细胞培养、组织工程与再生医学、干细胞研究和单细胞研究等生命科学领域具有重要价值。本文主要综述了基于液滴微流控技术的细胞凝胶微球的制备及其在生物医学领域的应用，并对未来的研究工作提出了展望。

1 液滴微流控

微流控技术是一种可以在微纳米尺度上处理和操控少量液体(10–9−10–18 L)系统的技术，基于微流控技术的装置称为微流控芯片，具有微型化、集成化等特点。液滴微流控是指通过微通道内互不相容的多相流体生成离散的液滴，并对其进行操控。基于微流控技术生成的液滴具有单分散性好、无交叉污染、可重复性高等优点，广泛应用于生物、化学、物理等多个学科领域，成为微流控领域的一个重要分支。

生成液滴的方法和技术有很多种，根据液滴生成过程中是否施加外部能量，可以分为被动法和主动法。被动法生成液滴，是指利用不同的微通道结构使不混溶的分散相和连续相流体在通道连接处相遇，通过调节通道结构、两相流速大小及流速比，可以在通道连接处下游生成大小可控的液滴。根据通道几何形状的不同，被动法生成液滴(表 1)又可以分为T型通道法(T-junction)、流聚焦法(flow-focusing)和共轴流法(co-flow)。主动法生成液滴是指在液滴生成过程中，通过局部施加电场力、磁场力和离心力等外力控制液滴的生成(表 2)。

近年来，液滴微流控技术的发展主要体现在以下几个方面：在芯片制造方面，由于新材料的不断引入和技术的进步，微流控芯片经历了由硅、玻璃、聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)到纸基材料的变化；在液滴生成动力学方面，深入研究了液滴的生成原理，即液滴通常是在被动的流体压力或主动的外部驱动下生成的，了解其独特的流体动力学可以对液滴及液滴界面进行精确控制，也使得设计新颖的液滴微流控系统来生成和操纵具有不同结构和功能的液滴成为可能；在应用方面，随着理论和技术的进步，液滴微流控在微反应器、组织工程与再生医学、药物输送、人工细胞、肿瘤免疫疗法和单细胞研究等诸多领域均占据了重要的一席。

2 细胞凝胶微球的制备

液滴微流控技术能够以高通量的方式制备大小、成分和功能可控的单分散液滴，这些液滴可以封装一种或多种细胞，作为模板来制备具有特定理化性质且能够抗剪切应力的细胞凝胶微球。用来进行封装细胞的水凝胶材料种类繁多，主要可以分为两大类：一类是天然高分子，包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、明胶、纤维蛋白原和多肽等；另一类是合成聚合物，包括聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)、聚丙烯酸(polyacrylic acid, PAA)和聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)等。天然高分子具有良好的生物相容性和可降解性，合成聚合物在机械性能和生化信号的可控性方面具有优势，因此，实际应用中通常采用混合水凝胶，结合二者的优势，能够为细胞提供可控的微环境和必要的锚定位点，并调控细胞的生命活动。

在典型的细胞封装过程中，含有细胞的水凝胶前体溶液经过连续相的剪切，形成一个个单分散液滴，通过触发交联，形成细胞凝胶微球。微球的尺寸、形状、孔隙率和机械性能可以通过改变微通道尺寸、两相流速、水凝胶材料、水凝胶浓度以及交联密度等因素来调节。根据封装细胞的水凝胶材料的不同，制备细胞凝胶微球的交联方式各异，主要包括光交联、离子交联和温度诱导交联等(图 1)。

2.1 光交联

光交联通常是在可聚合材料中加入光引发剂，待生成前体液滴后再将其置于可见光或紫外光的照射下引发聚合。这一过程发生速度快，可在数秒内诱导交联，液滴稳定性好，对细胞的损伤较小，是目前应用最广泛的交联方法之一。光交联的关键除了光引发剂的选择和严格控制光引发剂的浓度与光照时间外，选择合适的可聚合材料也很重要。目前，可用于构建光交联的生物相容性水凝胶材料主要包括透明质酸、明胶和壳聚糖等天然大分子以及聚乙二醇、聚丙烯酰胺和聚丙烯酸酯等合成大分子。Finklea等将人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)包裹在聚乙二醇修饰的纤维蛋白原前体液滴中，液滴在可见光下照射1.6 s即可完成交联，形成载hiPSCs的凝胶微球。聚乙二醇修饰的纤维蛋白原水凝胶显示出优异的生物相容性和机械性能，载hiPSCs凝胶微球在诱导分化第8天即可分化为心脏组织，该工程化心脏组织呈现自主收缩功能，并保持自发收缩长达3年以上，能够对药理学和电刺激产生反应。

2.2 离子交联

可用于细胞封装的离子交联水凝胶主要包括海藻酸盐和壳聚糖，其中海藻酸盐是研究最多的材料之一。海藻酸盐对二价阳离子(如Ca2+)有很强的亲和力，其带负电荷的多糖残基可以与Ca2+发生离子反应，从而触发交联，交联剂Ca2+的浓度显著影响海藻酸盐水凝胶的交联度。当Ca2+浓度较高时，形成的海藻酸盐水凝胶结构比较紧密，特别是水凝胶的外部会直接接触含有Ca2+的水溶液，从而在接触瞬间发生固化。而当Ca2+浓度较低时，固化速度相对较慢，形成的海藻酸盐水凝胶结构更均匀，具有更高的机械稳定性。由于离子交联发生迅速，当液滴形成和凝胶化同时进行时，容易导至微通道堵塞以及凝胶化不均匀，因而Utech等以钙-乙二胺四乙酸(Ca-EDTA)络合物的形式提供Ca2+。他们将Ca-EDTA络合物水溶液与多肽(Arg-Gly-Asp, RGD)修饰的海藻酸盐水溶液均匀混合作为分散相，此时由于Ca2+与EDTA络合，Ca2+不会与海藻酸盐发生交联。当液滴形成后，通过向连续相中添加低浓度的乙酸降低液滴中的pH，使得Ca-EDTA络合物发生解离并释放出Ca2+，进而引发交联。Utech等利用该方式制备了包裹间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的海藻酸钙凝胶微球，可以观察到微球中的MSCs在培养过程中稳定增殖，培养至第15天时细胞存活率仍保持在70%以上。

2.3 温度诱导交联

温敏材料通常都是通过分子间的氢键、疏水作用、范德华力以及π-π作用等较弱的相互作用而形成的，温度的改变会影响或破坏这些作用，从而使凝胶状态发生改变。故可以通过调节外界温度，触发对温度敏感的水凝胶发生交联。可用于细胞封装的温度敏感性水凝胶主要包括胶原蛋白、琼脂糖、明胶和壳聚糖等天然大分子。此外，还可以通过在天然水凝胶上修饰人工合成基团，比如在壳聚糖上修饰PEG或PVA大分子，进一步优化水凝胶的温度敏感性、溶解性和机械性能。已知胶原蛋白处于4 ℃时是液体状态，而当温度上升到37 ℃时则转变为凝胶态。基于此，Kukla等在4 ℃环境下将原代人肝细胞(primary human hepatocyte, HPP)重悬于Ⅰ型大鼠尾胶原蛋白溶液中，借助流聚焦型液滴微流控芯片生成了包裹HPP的胶原蛋白前体液滴。收集液滴并将其置于37 ℃环境下孵育以促进胶原蛋白凝胶化，最终形成平均直径在267.4 μm左右的“微组织”。这种“微组织”不仅可以作为3D人体肝脏模型用于临床前药物开发，还可以通过与不同细胞共培养来研究肝脏疾病中细胞-细胞和细胞-细胞外基质(extracellular matrix, ECM)之间的相互作用。

细胞凝胶微球在生物医学领域的应用

人体内的细胞存在于由蛋白质和多糖组成的复杂三维微环境—ECM中，天然的ECM是一种动态的、层次分明的物质，它不仅是细胞的结构基础，也是触发和调节细胞行为的生化和生物物理因素的来源。然而，现有的细胞培养大多是建立在二维培养皿培养的基础上，这种二维培养难以真实地反映细胞的体内微环境。水凝胶具有高含水量、生物相容性、降解性和多孔性等与天然ECM相似的独特性能，并且可以方便地调整其组成、结构、机械性能和生化性能，因而其作为一种人工ECM在生物医学领域发挥着重要的作用。基于液滴微流控生成的细胞凝胶微球呈三维多孔结构，粒径通常在60−200 μm之间，其多孔结构和高表体比有利于氧气和营养物质的输入以及代谢废物的输出，能够使细胞在保持高活力的同时免受周围微环境的影响。此外，还可以在水凝胶中加入适宜的生长因子，构建能够控制细胞生长、增殖和分化的人工ECM，生长于其中的细胞可以很好地与包裹它的水凝胶相互作用，因而这是一种有前途的体外三维细胞培养平台。本节主要讨论三维细胞凝胶微球在组织工程与再生医学、单细胞研究、肿瘤疫苗等领域的应用(图 2)。

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