杂交瘤技术制备单克隆抗体：详细流程与常见问题解析

xiaoqin

杂交瘤技术是一种将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合生产单克隆抗体的传统方法。该技术通过将动物脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生永生化杂交瘤细胞系，然后筛选其上清液中的抗原特异性克隆，并进一步循环亚克隆以产生严格的单克隆抗体。

利用杂交瘤技术制备单克隆抗体通常操作流程为：抗原制备、抗原免疫动物、杂交瘤细胞制备、融合细胞的筛选、培养杂交瘤细胞制备抗体。（详细实验流程：杂交瘤单克隆抗体制备SOP）在单克隆抗体制备过程中，常常会遇到细胞污染，细胞融合后不生长、亚克隆后的细胞株不分泌抗体以及细胞难以克隆等问题，本文将详细分析以上常见问题的产生原因以及解决该问题的方法。

一、微生物污染

①细菌、真菌污染主要是由于实验人员操作不当或者消毒不到位引起的。人身上可能携带各种孢子，如果操作不当，或者是未能及时到位的消杀，就有可能会引入污染。除此之外，还须注意平时使用的一些消毒剂，比如84消毒液或者75%酒精，要确认它的纯度以及质量。如果是因为这些问题导至的消毒不到位，是非常不容易发现的。

②支原体污染则可能由血清制品、关键试剂材料或实验人员带入。正常的SP2/0细胞圆润透亮，当被支原体污染后，短期内细胞没有明显的变化，当污染严重后，细胞生长会变得极为缓慢，生长周期变长，细胞形态多样。可通过加入商品化的清除支原体试剂，或者通过将污染的杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔，待产生实体瘤后或产生腹水后，无菌分离重新获得杂交瘤细胞。

③原生生物污染主要是大家比较头疼的黑胶虫，污染后会陆续出现多少不等的小黑点。

二、融合后细胞不生长

①融合后细胞不生长可能是因为融合试剂有毒性，部分毒性试剂作用时间过长引起的。如PEG在10%~60%都可以进行融合，但浓度越高毒性越大。

②也有可能是使用血清质量比较差，推荐使用胎牛血清。

③还有可能是因为添加的HAT试剂中氨基喋呤（A）含量过高或HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷）含量过低。

三、杂交瘤细胞不分泌抗体或者停止分泌抗体

1、杂交瘤细胞不分泌抗体，可能的原因有以下几种：

a.抗原免疫原性弱，免疫效果不好，可以通过多方案检测血清效价进行进一步评估；

b.操作过程中脾细胞损伤较多，抗原特异性淋巴母细胞大量死亡；

2、杂交瘤细胞前期有抗体分泌，后期在克隆化过程中抗体分泌量减少或停止分泌抗体，可能的原因有以下几种：

a.HAT试剂中氨基喋呤（A）失效，骨髓瘤细胞增殖抑制杂交瘤细胞的生长；

b.未及时克隆，不分泌抗体的杂交瘤大量生长挤占生存空间；

c.骨髓瘤细胞返祖化，抵抗氨基喋呤（A）的选择；

d.梁色体丢失（突变）;

e.支原体污染。

解决方法有三种：第一，及时进行细胞建库；第二，高频次检查细胞状态和是否污染；第三，定期进行抗原筛选。

四、杂交瘤细胞难以克隆化

一旦确认有分泌抗体的杂交瘤细胞，就应尽快进行克隆化。克隆化的目的是为了获得单一细胞系的群体，反复克隆化后可获得稳定的杂交瘤细胞株。杂交瘤细胞若难以克隆化，可以尝试以下解决方法：

①使用已有杂交瘤细胞株对血清进行筛选，确定最佳批次的血清和使用浓度；

②融合后第一次克隆（一亚）仍需采用含HT的条件培养；

③在培养体系中加入白细胞介素6（IL6），一般商品化的杂交瘤因子都含有IL6。

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