核酸等温扩增技术

Okay欧凯

核酸等温扩增技术（nucleic acid isothermal amplification technology）是一类分子生物学技术的统称，该技术可在某一特定温度下，扩大特定DNA或RNA片段的拷贝数。核酸等温扩增技术属于核酸扩增技术（nucleic acid amplification technology，NAAT）范畴，在疾病的临床诊断中，核酸扩增技术以其快速、灵敏、特异的优势，使以往无法完成的诊断成为了可能。与PCR技术相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使其对仪器的要求简化，反应时间大幅缩短，可通过加热模块、水浴槽等简单的，甚至是非专业的设备完成反应。因而，更能满足现代分子检测技术快速简便的需求，具有较大的实际应用价值。

分类

随着技术发展，产生了一系列新型核酸等温扩增技术，主要包括环介导核酸等温扩增（LAMP）、依赖于核酸序列的扩增（NASBA）、滚环扩增技术（RCA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、依赖于解旋酶的等温扩增（HDA）、链替代扩增技术（SDA）、自主序列复制系统（3SR）、单引物等温扩增（SPIA），同时还有快速等温检测放大技术（RIDA）和切刻内切酶核酸恒温扩增技术（NEMA），本文主要介绍前6种技术。

核酸扩增检测方法有两种基本分类方式。以扩增的目标不同可分为目标扩增（target amplification）和信号放大（singal amplification）；以扩增对象的类别不同可分为“DNA扩增”和“RNA扩增”。目前的核酸等温扩增技术主要以目标扩增和DNA扩增为主（表1）。

注：目标放大是通过增加目标序列拷贝数实现检测目的；信号放大是通过检测目标序列后对获得信号进行放大实现检测目的。

表1. 核酸等温扩增技术分类

	LAMP	NASBA (3SR)	RCA	RPA	SPIA	HDA	SDA	RIDA	NEMA
目标放大	✔	✔		✔	✔	✔	✔		✔
信号放大			✔					✔
DNA扩增	✔		✔	✔	✔	✔	✔	✔	✔
RNA扩增		✔						✔

1. LAMP

1） 原理

LAMP在60~65℃条件下进行，需要4条引物和具有链置换功能的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶（DNA polymerase of Bacillus stearothermophilus，Bst DNA聚合酶）。外引物与PCR引物类似，而内引物则含有两段序列。反应过程如下：（1）内引物结合目的基因，在BstDNA聚合酶的作用下延伸为双链。外引物与双链DNA的5′端结合，在一端形成环状结构。另一端经过同样过程，形成两端为环的哑铃状结构。（2）哑铃状结构的单链DNA具有模板与引物的双重功能，在Bst聚合酶的催化下即能延伸。（3）内引物也能与环状结构结合，在酶的作用下进行延伸。

2） 优点

等温扩增：在一种恒定温度下完成扩增反应，无需循环温度变化；

快速高效：整体扩增反应可以在30-60min内完成，扩增出109-1010倍靶序列拷贝

特异性高：4个引物靶向6个区域决定了LAMP的高特异性，其中6个独立序列在扩增起始阶段决定靶序列识别，而后续扩增反应中，则由4个独立序列决定识别；

灵敏度高：LAMP能检测到PCR检测限1/10的拷贝数，扩增模板可达10拷贝或更少；

检测方便：无需昂贵设备支撑且产物量多，可利用直观的焦磷酸镁浊度检测法或荧光目测比色法对扩增结果进行检测。

3） 缺点

不易区分非特异性扩增：LAMP结果判读只有扩增与不扩增两种，一旦发生非特异性扩增，不易区分；

无法用于长片段扩增：LAMP要求靶序列长度不能过长，一般不超过300bp，不宜用于长片段检测。

2. NASBA

1）原理

标准NABSA反应体系中含有T7RNA聚合酶、RNase、禽骨髓白血病病毒（AMV）逆转录酶、核糖核苷三磷酸（NTP）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、一对特异性引物和缓冲液。NABSA整个反应分为两相：非循环相和循环相。在非循环相，引物Primer1与模板RNA退火，AMV逆转录酶催化合成一条cDNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解杂交分子上的RNA，留下一条单链DNA。引物Primer2随后与这条DNA链的5'末端退火，AMV逆转录酶催化合成第二条DNA链。T7RNA聚合酶识别双链DNA中的启动子区，催化DNA转录为RNA。新合成的RNA进人循环相，成为反转录的模板。它们首先与引物Primer2结合，由AMV逆转录酶催化合成一条DNA链，形成RNA-DNA杂交分子，RNaseH水解RNA，留下一条单链DNA，引物Primer1退火，逆转录酶再催化合成一条新的含有T7RNA聚合酶启动子的DNA片段，T7RNA聚合酶再以此DNA为模板成更多拷贝的RNA，如此循环反复，RNA拷贝数被不断放大。

2）优点

操作简单：不需要模板热变性、长时间温度循环等过程；

扩增效率高：只需4-5个循环就可将RNA扩增109倍；

保真度高：NABSA的高效性缩短了反应时间，从而降低酶促反应过程中核苷酸错配几率；

特异性强：无热变性步骤，不受样品中DNA、肝素、EDTA等污染物的影响；

灵敏度高：反应产物为单链RNA，可采用杂交检测系统提高技术的敏感性和特异性。

3）缺点

效率低：扩增更长RNA靶标时效率低，需要变性步骤启动该过程；

成本高：反应过程中需多种酶参与，成本高昂。

3. RCA

1）原理

滚环扩增技术是一种基于等温酶的技术，使用具有链置换活性的聚合酶扩增靶标。RCA反应中有五个基本组分：（1）短线性DNA/RNA链，用作利用环状模板的引物；（2）具有5′-磷酸基团修饰的环状模板或挂锁探针；（3）特异性DNA/RNA聚合酶（如Phi29 DNA聚合酶）；（4）DNA/RNA连接酶（如T4 DNA连接酶）和（5）脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）。首先，在线性引物和线性探针杂交后可以引发RCA反应，从而诱导形成圆形结构。连接酶可以通过DNA/RNA糖骨架的磷酸基团共价连接环状模板的两端，形成闭环结构。随后，DNA/RNA聚合酶从5′→3′方向催化聚合。RCA产物是一种长单链DNA连接体，包含与挂锁探针序列互补的重复序列。与其他核酸扩增方法相比，RCA反应可以在约23°C至60°C的低温下进行。

2）优点

高灵敏度：RCA有很强的扩增能力，线性RCA的效率可达到105倍，而指数RCA的效率可达到109倍，具有检测单拷贝的潜力；

高序列特异性：可以区分单一位点的不同模式；

高通量：RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增；

操作简便：扩增产物经过磷酸化处理后可直接用来测序。

3）缺点

成本高：锁式探针接近100bp，合成费用高；

存在背景干扰：信号检测时存在背景干扰问题。

4. HDA

1）原理

HDA 模拟体内DNA半保留复制过程，该反应在37 ℃左右进行，依赖于解旋酶、单链结合蛋白（SSB）、DNA聚合酶及一对引物。过程为：DNA双链在解旋酶的作用下解开，SSB与单链DNA结合保持其稳定；同时引物与单链结合，在聚合酶的催化下形成双链；新合成的DNA双链作为模板进入新一轮扩增。

2）优点：反应迅速、灵敏度高、全程恒温，可直接用于热处理裂解后的鼻咽拭子样本。

3）缺点：受解旋酶速度限制，只能扩增短片段，易产生引物二聚体、脱靶杂交体等。

5. SDA

1） 原理

SDA反应温度约为37℃，反应需要限制性核酸内切酶、链置换DNA聚合酶和两对引物，且其中一对引物（Primer1和Primer2）含有内切酶识别序列。反应开始时Primer1和Primer2与模板链互补结合，在聚合酶的催化下延伸为双链，随后内切酶识别双链两端的酶切位点，切割形成黏性末端。第二对引物结合模板链末端，在聚合酶的作用下合成新链同时置换出一条单链。

2） 优点：反应时间短（约15-20min），与横向流动试纸条、荧光免疫技术等结合可实现即时检测。

3） 缺点：需昂贵的酶类和非标准核苷酸、不能完成长片段扩增，且产物两端残留核酸内切酶识别序列。

6. RPA

1）原理

RPA反应温度为37-42℃，反应体系包括1对引物和3种关键酶：能与寡核苷酸引物结合的重组酶、单链DNA结合蛋白（SSB）和链置换DNA聚合酶。反应开始时引物与重组酶结合形成引物重组酶复合物，并与模板链上相应位点互补结合，导至双链DNA构象发生改变，并在具有链置换特性的DNA聚合酶的催化下延伸形成完整双链。反应时单链结合蛋白结合游离单链，保持其稳定性。

2）优点：具有高特异性和扩增效率，冻干试剂也可以使用。

3）缺点：扩增体系中含大量酶类，去除蛋白质后才能电泳或进行后续实验。

表2. 等温扩增技术的比较

方法	模板	引物 （条）	酶数量 （个）	温度 （℃）	产物	优点	缺点	临床应用
LAMP	DNA	4	1	约65	DNA	涉及酶类少 灵敏度特异度高	引物复杂 假阳率高	病原体检测 基因突变检测
SDA	DNA	4	2	约37	DNA	效率高、快速简单	不能扩增长片段 要加入非标准核苷酸	蛋白质检测 病原体核酸检测 细胞免疫测定
RPA	DNA	4	2	37-42	DNA	反应时间短	电泳检测需对产物进行纯化	病原体检测 突变基因检测与癌基因分型
NASBA	RNA	2	3	约42	DNA、RNA	产物为单链RNA	反应成分复杂 酶类成本高	病原体核酸检测 尤其是RNA检测
RCA	DNA	≥1	1	约37	单链DNA	种类多，应用广 产物为单链DNA	需要环状DNA模板	病原体核酸检测 癌基因检测 miRNA检测
HDA	DNA	2	3	约37	DNA	引物设计简单	只能扩增短序列	病原体核酸检测 miRNA检测