细胞实验 | 你数的细胞靠谱吗？

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细胞培养是基础科研的基本功，是实验中最常见的试验。此实验很友好，非“玄学”，在细胞培养过程中，有时需要进行细胞计数，虽然试验比较简单，但是经常晕头转向、数到眼瞎，而且万一一个不小心被其他人打断了思路，分分钟前功尽弃。今天我们就来聊聊细胞计数那些事儿。

01

制备细胞悬液

对于贴壁生长的细胞，我们需要首先使用胰酶消化的方法使细胞从培养皿表面脱落；根据需要加入合适体积的培养基，将细胞进行中和及稀释，以得到均质的细胞悬液；要求尽可能将细胞吹打散开，不要残留任何细胞团。

Tips：有些易结团的，用手指弹打外壁，也达不到吹散目的，建议至少用吸管吹打10次左右。

02

准备血细胞计数器

使用70%乙醇将盖玻片和血细胞计数器清洁干净；将盖玻片润湿（使用水或呼一口气，目的是使盖玻片与血细胞计数器接触更紧密，易于粘连），并覆盖至血细胞计数器上；

03

台盼兰染色（可选）

如果需要计算细胞的活力，则需要将细胞悬液和0.4%台盼兰等体积混合；室温孵育，使台盼兰完全进入死细胞，使死细胞着蓝色。

Tips：建议台盼兰溶液务必0.22um过滤，过滤后的0.4%台盼兰溶液可以低温保存1个月左右；与细胞1:1混合的时间不要超过10min，尽可能控制在5分钟内，混匀后，混合现用。

04

血细胞计数器加样

使用吸管将细胞悬液或细胞/台盼兰混合液滴加到血细胞计数器计数池的边缘。此时液滴将在虹吸的作用下进入盖玻片下方的计数池；以同样的方式在另一侧的计数池中也加入细胞悬液；将计数板放置几分钟使细胞完全扩散，同时用吸水纸吸除多余的液体。

05

细胞计数

在100倍显微镜下，移动计数板将视野对准计数板的中央大方块，该方块四周有一圈3条平行线包围，中间有密集的网格。中央方块区差不多刚好可以填满整个视野（下图中标记的3号位置），血细胞计数板的示意图：

图1 血细胞计数板的示意图

分别计数大方格1、2、4、5中的细胞数(为降低计数误差，最好将细胞浓度调整为20-50个/大方格)，并重复记录另一侧计数池中的细胞数，总计8个大方块，然后取均值。

计数的方法是只计算上边和左边压线的细胞，而右边和下边压线的细胞不予计算（图2，总体原则是“计上不计下，计左不计右”，判断标准为是否接触三条边线的中间线）。如果有多个细胞没有吹散成团存在，此时只可记为一个细胞。如果团块很多，则可能需要重新吹打甚至消化直至绝大多数细胞为单个细胞。

图2 计算原则

06

计算细胞数

图3规格为1mm×1mm×0.1mm的血球计数板

• 如果选用规格为1mm×1mm×0.1mm的血球计数板，血细胞计数器每个大方块可以容纳的体积：
  1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4 cm3 = 10-4mL，也即每个大方块的体积为万分之一毫升，因此在计算每毫升液体中的细胞数时需要乘以104。
• 在常规没有使用台盼兰染色时，可以以下面公式计算每毫升样品中细胞的个数：
  每毫升样品中细胞的个数 = 每个大方格内细胞的平均数 × 细胞稀释倍数×104。
• 如果使用了台盼兰染色，还需要计算活细胞的百分率：活细胞百分率(%)= 台盼兰拒染细胞数/总细胞数×100此时活细胞数的计算公式为：
  每毫升样品中活细胞的个数 = 每个大方格中细胞的平均数×活细胞比率×细胞稀释倍数×2×104。
  
  

注：乘2是由于在台盼兰染色时，进行了等体积混合，相当于稀释了一倍。

所以尽管使用血细胞计数板手工计数细胞过程十分繁琐，对实验者操作者的要求也比较严格，现在也已有很多自动化的细胞计数器/仪，但对于科学研究中遇到的各种细胞而言，手工计数仍然是最简便易行的方法而被广大实验室采用。