重组酶聚合酶扩增

Okay欧凯

自20世纪90年代初以来，大量的等温核酸扩增方法涌现，有基于核酸序列的扩增（NASBA，又称转录介导扩增，TMA）、信号介导的核糖核酸扩增技术（SMART）、解旋酶依赖性扩增（HDA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、滚环扩增（RCA）、多重置换扩增（MDA）、环介导的等温扩增（LAMP）和链置换扩增（SDA）。其中RPA反应条件温和，扩增效率高，非常适合临床快速诊断、食品检测、疫情防控、工业应用、现场实时检测等应用。

1. 简介

与PCR等温扩增方法相比，RPA具有操作简单、反应速度快、对设备要求低等优点。在灵敏度方面，RPA可以检测最低水平样品中的痕量核酸。在一些研究中，RPA甚至可以检测到PCR无法检测到的低浓度DNA。在特异性方面，RPA可以从不同物种和标本类型的基因组DNA中识别和扩增靶基因。RPA抗干扰能力强，检测结果可与PCR高度一致。此外，RPA可以在37-42°C下运行，无需复杂的温度控制设备，非常适合资源匮乏环境下的现场检测，并可以在20 min内得到检测结果，有利于样品的大规模筛选和快速检测。

2. 反应机理

重组酶聚合酶扩增技术通过模拟DNA体内扩增，在等温条件下产生目的片段。该技术主要依赖重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶。重组酶能够不通过加热就解开双链DNA。重组酶聚合酶扩增反应开始时，重组酶在ATP的参与下结合引物，形成核酸蛋白复合体，这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，实现DNA的指数增长。

3. RPA检测的影响因素

RPA的突出之处源于其特定的反应成分和机理。RPA检测的细微差别取决于内在因素（如引物、探针和核酸模板的设计），并与外在因素有关（如反应温度和搅拌、对错配的耐受性、抑制剂和背景DNA）。此外，RPA过程中的核酸标记、RPA扩增产物的清理和扩增后处理也是实现RPA检测的重要细节。

3.1 RPA模板、引物、探针及其设计

RPA试验中DNA模板的GC含量应在40%-60%之间，并且应避免长同质聚合物轨道、少量直接/反向重复和回文序列；引物GC含量应在30%-70%之间，5′端应避免鸟嘌呤长迹，推荐胞苷类；引物3′端推荐添加鸟嘌呤和胞苷，以提高性能。此外需要避免引物和探针之间的重叠，减少对扩增效率的影响。

v 模板

RPA最初被证明是一种DNA核酸扩增方法，后来发现通过添加逆转录酶，RNA 也可以作为模板。无论和核酸模板类型如何，在试验中推荐RPA扩增子长度应低于500个核苷酸，大多数RPA扩增子长度在100到250个核苷酸之间，在此区间内会产生快速有效的扩增。

v 引物

与PCR不同，RPA引物的长度相对较长（建议至少为30个核苷酸，但通常在32至35个核苷酸之间）。较短的PCR引物（通常在18到25个核苷酸之间）也可以用于RPA反应，但可能会降低反应速度和灵敏度。

v 探针

TaqMan等传统探针不能用于RPA，PCR Taq聚合酶也与扩增系统不兼容，对于实时检测通常使用2种探头，RPA-exo或fpg。exo探针是一个长寡核苷酸（46-52个碱基），带有内部碱基类似物（如四氢呋喃，THF），位于荧光基团和淬灭剂之间，具有封闭的3'末端。非碱性残基用作酸外切酶的底物，只有在探针与靶序列结合后才能切割THF，荧光产生通常在RPA反应期间的5-10分钟内产生可检测的信号。与exo探针相比，fpg探针更短（32-35个碱基），它具有5′淬灭剂和下游5-6个碱基的荧光团，通过C-O-C接头连接到非碱性核苷酸的核糖上。fpg是一种8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶，它识别并切割荧光团，同时留下2个不可延伸的序列，是与核酸外切酶不同的催化模式。

3.2 温度和搅拌的影响

反应温度和反应过程中的搅拌是两个重要的外在影响因素。

v 温度

推荐的RPA反应温度在37-42℃之间，但在低至25℃的温度下，经过RPA放大和随后的侧流条带检测，仍然可以产生正信号。此外，环境温度对RPA反应也有影响，当环境温度低于10℃时，RPA反应不稳定，但延长反应时间可以提高阳性结果的可得性。

v 搅拌与震荡

反应温度为RPA中的酶提供了合适的工作环境，而搅拌则可以增加均质溶液反应中RPA组分之间的相互作用。建议对RPA反应执行两次混合步骤，一次在过程开始时，另一次在反应4分钟后。前者是混合所有RPA试剂来引发反应，后者是为了防止反应试剂局部耗尽，从而提高反应速率。

此外，在整个RPA反应过程中不断震荡混匀，可以进一步加快RPA反应速度，特别是当模板浓度接近检测极限时，可获得更稳定的阳性结果，提高灵敏度。

3.3 对错配、抑制剂和背景DNA的耐受性

除了温度和搅拌，对错配、抑制剂和背景DNA的耐受性也是实现高效、灵敏RPA反应的重要因素。

v 错配

RPA具有耐错配能力，引物5′端或中心的错配只会轻微地影响RPA反应，由于聚合酶从3′端延伸引物和探针，所以位于3′端的错配对反应有显著影响。然而，一般的RPA错配容忍度（在引物3′端之外）可能是有利的，因为它针对高度多态的靶标引物设计提供一定的灵活性。在高度多态的靶标中，很难定位长期保守的靶区，所以这种错配耐受性的缺点是倾向于对密切相关的物种进行非特异性检测。

v 抑制剂和背景DNA

在测试临床或现场样品时，可能会在样品制备和处理时引入干扰物质（如抑制剂），影响核酸扩增。研究表明RPA对一些聚合酶抑制物有耐受性，例如，当血红蛋白（20gL-1）、肝素（0.5U）、尿液（1.25%）时对RPA反应无影响；但在十二烷基硫酸钠（0.05%/v/v）和尿液（10%）存在下反应被完全抑制，同时在模板浓度接近检测极限时，反应更容易受到抑制剂影响。除了对抑制剂的耐受性外，RPA还能够在背景DNA存在的情况下扩增靶核酸，与对抑制剂的耐受性类似，对背景DNA的耐受性也是与浓度相关的，背景DNA浓度越高，受到的抑制就越明显，反之就越小。在试验中，应针对每种应用类型调整最佳样品制备方法，并综合考虑多种因素。