分析方法 | HPLC方法开发中色谱柱如何选择？

宋宋030688

反相液相色谱方法开发色谱柱的选择一般有两种方法，一种是基于实际经验，另一种则是基于理论知识，包括固定相和分子的化学性质。今天我们来聊一聊如何基于理论知识选择合适的色谱柱。首先我们要了解目标分子中存在的官能团，以及它们是如何与固定相相互作用的。

一、化合物中常见基团的作用力

1. 亚甲基

在亚甲基链是CH2的情况下，存在其他官能团，那么该官能团的极性很低或几乎是非极性的。非极性分子，可以与伦敦分散力模式下的固定相相互作用，保留机制主要由伦敦分散力决定。

2. 苯基

苯基，存在伦敦色散力，同时也有少量π-π相互作用，能有助于化合物的保留。

3. 卤化物：F、Cl、Br、I

卤化物中的F、Cl、Br、I都具有很强的电负性，这些化合物在自然界中都是极性的，会带来偶极-偶极相互作用。如果分子中有卤素原子，那么分子可以通过偶极-偶极相互作用与固定相相互作用，再加上亚甲基或羰基链还能带来一定的伦敦色散力。

4. 醚基

醚，氧也是高度电负性的原子，这也会带来偶极相互作用，加上伦敦色散力，因为氧的两侧都有烷烃基团。除此之外，如果另一种化合物上有氢，这种氧也可以与其形成氢键，所以醚可以通过伦敦色散力、偶极相互作用，甚至通过氢键，保留在固定相上。

5. 硝基

硝基也是极性官能团，氮是电负性很强的元素，所以会发生偶极相互作用和氢键作用。

6. 酯基

酯，存在伦敦色散力、偶极相互作用和氢键作用。

7. 醛基

醛，存在伦敦色散力、偶极相互作用和氢键作用。

8. 酮基

酮，由于烷烃链，存在伦敦色散力，以及氧原子的高电负性，存在偶极作用力。在酮官能团上存在的氧也可以形成氢键。

9. 氨基酸

由于烯烃链是高度非极性的链，它可以通过伦敦色散力的机制与状态界面相互作用，因此氨基酸可以在伦敦色散力的作用下得到保留。此外，由于氨基中存在氮，因此具有偶极相互作用，这种氮也可以与具有氢原子的化合物形成氢键。

10. 酸碱基团

如果固定相中有一些酸碱官能团，如羟基是R-OH，R可以带来伦敦色散力，氧是电负性很强的原子，能引起偶极-偶极作用，它还能与另一个含氢的化合物形成氢键。羧酸的伦敦色散力是由于烯烃链的偶极子，偶极子是由于氧原子存在于羧酸官能团内部，形成氢键。

这些就是化合物能保留在固定相上的主要原因。

二、案例分析-1

现在让我们通过实际的例子来理解，假设必须分离泼尼松和泼尼松龙。首先了解这两个目标分子的化学结构，圈出不同的结构特征，需要确定这些结构特征是什么或者这两个分子中不同的官能团是什么，来了解其中的差异。

通过观察我们可以发现，Prednisolone存在羟基，而在Prednisone结构式中同样的位置是羰基。我们使用最广泛的固定相中，第一种是烷基键合的固定相，如C8、C18，第二种是氨基，第三种是苯基五氟苯基（PFP），然后是氰基，最后是未键合的纯硅胶。因此，我们尝试分析泼尼松龙和泼尼松的保留情况。

我们知道C18固定相本质上是高度非极性的,是高度疏水的，它们只会保留高度疏水或非极性的分子。Prednisolone和Prednisone结构中存在许多π键、双键以及氧这种高负电性原子，这将使这两种化合物是高度极性的，所以C8或C18不会是首选。在这两种固定相上，Prednisolone和Prednisone的保留时间几乎相同，并且保留很弱，因为这两种化合物与烷基键合的固定相相互作用的可能性很小。

再看看酰胺固定相，酰胺固定相上存在氮，可以形成氢键，因此酰胺固定相将与极性化合物Prednisolone和Prednisone相互作用。Prednisolone具有与氧一起可用的氢，但在Prednisone的情况下，该氢缺失或共享，因此该羟基可以与酰胺固定相有更多的相互作用。由于目标化合物和固定相都有较强的极性，因此，化合物将有更好的保留，但由于氢键的形成，Prednisolone具有更强的保留，因此，可以考虑采用酰胺固定相来进行分离。

苯基固定相，苯环是路易斯碱，它可以通过π-π作用力或氢键作用力进行相互作用。与Prednisolone相比，Prednisone缺少可形成氢键的氢，因此，苯基固定相很有可能与Prednisolone的相互作用更好。这样，就可以实现两种化合物的分离。但苯基在性质上极性不是很强，因此，保留时间可能很短，正因为如此，苯基可能也不是首选固定相。

现在来看看五氟苯基，这个五氟苯基是一个极性很强的固定相，因为有五个氟原子。氟是高电负性原子，它能非常强烈地吸引极性化合物，存在强烈的偶极-偶极相互作用。因此，在PFP上这两种化合物可能会获得良好的保留。羟基上的氢可以和氟原子形成氢键，从而使这两种化合物分离，PFP是个不错的选择。

氰基柱，是极性很强的色谱柱，氰基也可以形成氢键，因此，根据两种化合物形成氢键的能力不同，可以进行分离，也是不错的选择。

最后是二氧化硅，它是极性很强的固定相。这两种化合物都是极性化合物，所以二氧化硅也可以成为另一种选择，但可能需要使用正常相模式。

三、案例分析-2

再举一个例子。在这个例子中，甲苯和乙苯作为两种不同的化合物，要将它们分离出来。甲苯和乙苯的区别是什么？是烯烃链。乙苯上有额外的CH2单元，烯烃链具有疏水性。

这种情况下，让我们了解下哪种固定相是首选？甲苯和乙苯的主要区别在于疏水性有差异，而烷基键合固定相就是基于疏水性的保留，因此，C8和C18可以是该分离的优选固定相。酰胺的烷基链也可以带来一定的疏水性，但与C8和C18相比，它并不是最佳选择。苯基在自然界中是非极性的，也可能不适合，PFP毫无疑问，在性质上也是高度非极性的。氰基是一种极性很强的固定相，对于这两种化合物的分离作用不大。现在我们可以知道，C8或C18甲苯和乙苯的分离是最有帮助的，因为它们能带来分离这两种化合物所最需要的疏水作用。

四、案例分析-3

现在让我们来考虑一下稍微复杂一点的情况，这是一种混合物，包含6种不同的化合物，需要将它们分离。我们已经了解到具有不同官能团的化合物，它们很容易被分离，但是在具有类似官能团类似结构的化合物中，分离就会面临挑战。

我们先找出在结构上非常相似的两种化合物，然后确定它们的官能团有什么不同，因为不同官能团的不同交互作用可以帮助我们将其分开。现在再来看看固定相，C8或C18这种烷基键合的固定相，它们控制这分子的疏水性，而这两种分子在自然界中是非常亲水的，它们是极性的。正因为如此，C8或C18可能并不是首选。酰胺固定相有助于保留极性官能团，化合物1中的NH2可以和酰胺固定相形成氢键，与化合物2相比，它可以得到更长的保留时间。因此，酰胺可以作为首选固定相。苯基，在这里也有一定的帮助，因为化合物1中存在苯环，而化合物2中没有苯环，因此，化合物1可以与苯基固定相发生π-π相互作用，得到更好的保留。此外，由于其极性，苯环还会带来偶极=偶极作用，化合物2也能得到一定的保留。PFP也是一种很有趣的固定相，五氟苯基与化合物1的两个苯环与之间有π-π相互作用，它还能与NH2形成氢键，因此，化合物1与PFP固定相有更大的亲和力，最终可以获得这两种化合物的良好分离。另一个是氰基，这也是一种非常有趣的固定相，因为它在自然界中也是一种极性很强的固定相，而我们的目标化合物的极性也很强。氰基能引起偶极-偶极相互作用，它的C-N三键也能与化合物1的NH2发生氢键作用。二氧化硅在这里不是首选，因为可能要用到正相色谱。

五、小结

在反相液相色谱方法的开发中，如果能从理论上分析化合物的这些官能团性质如何与固定相上的官能团进行相互作用，可以有效地缩小色谱柱的选择范围，然后进行试验，获得理想的色谱柱。