裸鼠皮下成瘤实验解析

无锡耐思NEST

认识裸鼠
裸鼠，又名无胸腺裸鼠。它是先天性胸腺缺陷、由于第VIII连锁群内**位点基因发生纯合而形成的突变小鼠。
裸鼠是由于nu基因有独特的遗传特性，成为科学研究中具有巨大潜力的试验模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。
本文将重点介绍裸鼠的成瘤实验方法。

常见成瘤细胞
常规较容易成瘤的细胞：Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大细胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人黑色素瘤细胞），SGC7901 人胃肿瘤细胞  ，KB人口腔表皮样癌细胞
可以成瘤但是比较慢的细胞：CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（结肠癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌  ， CT26 （小鼠结肠癌细胞 ），SH-SY5Y (人神经母细胞瘤细胞 ) ， U251 （人胶质瘤细胞） ， BGC-823（人胃癌细胞）  ，PC-3 （人前列腺癌细胞）
一些比较有争议的细胞：Hela（宫颈癌），HCT（人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞）。其他：BMSC（骨髓间充质干细胞）

操作流程（以Hep-G2细胞为例）
01准备对数期生长的、细胞密度达80-90%左右的Hep-G2细胞，于收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
02胰酶消化细胞，待细胞变圆未脱离培养皿时，去除胰酶，加入无血清培养基制成细胞悬液，离心清洗一次，重悬至终浓度为8×10^7个细胞/mL。
03将细胞悬液和高浓度基质胶在4℃环境下按1:1比例进行稀释，制备成终浓度为4×10^7个细胞/mL。
04左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左侧腋窝处皮下注射，接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，以减少注射后细胞悬液从针眼溢出，接种体积为100μL。(这一过程尽量在半小时内完成，途中细胞悬液放在冰上以减缓细胞凋亡及防止出现凝胶现象。）
05将裸鼠放回笼内继续饲养，大约1周左右可看到肿瘤出现，并根据实验设计在肿瘤体积不超过1000mm3前对裸鼠进行安乐死，取出肿瘤，拍照。

要点分析1.细胞的状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜，收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。
2.胰酶消化收集细胞，用PBS洗两遍去除残余血清(含多种抗原)
3.用PBS或基础培基重悬细胞并计数，由于细胞浓度较大，建议另取EP管稀释10倍后计数
4.计数后稀释至合适浓度，一般打1-5x10^6细胞/只，伦理要求不超过1x10^7/只，每只老鼠注射体积一般是100-200ul，如果细胞不易成瘤可添加基质胶(细胞悬液:基质胶=1: 1)
5.稀释好的细胞悬液放冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，由于细胞浓度高，每打一只都要用枪吹匀，避免细胞成团造成浓度不均，从而造成组内差异过大
6.一般选择5-6周龄裸鼠，小于4周可能不耐受过早死亡，大于6周免疫力会增强，不易成瘤
7.接种部位:选择血管丰富且易操作的部位接种，如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位，其中腋下中后部皮下较好，成瘤率高，比较推荐打腋下，一人操作很方便，后续量瘤子也很好操作
8.进针时先用针头刺破皮肤，持平注射器使针头在皮下行进一段距离(约0.5-1cm深)后开始注射，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内
9.注射过程不能太快，注射完毕后缓慢拔出针头，用棉签或棉球轻压进针孔避免细胞液流出(建议用胰岛素针，比较细不容易漏)
10.一般7-10天后可见肿瘤出现，一般每隔2-3天测量一次肿瘤大小，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位，V=1/2*a*b2(为长轴b为短轴)
11.肿瘤生长不宜过大，一般直径不超过15mm，体积不超过2000mm3


常见问题及解答
1.这个实验为什么用裸鼠而不用普通的老鼠或者小白鼠？
裸鼠成瘤实验用的裸鼠，最大的特点是没有胸腺等免疫器官，它的免疫力几乎为零，对肿瘤细胞没有免疫作用，易于成瘤。
2.瘤块为什么长起来又消失？
肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，长不起来建议换鼠。
3.是否可以在一只小鼠进行多个点接种？
不可以，一只老鼠就只能接种一个点，因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。
40肿瘤长不出来是怎么回事？
第一：肿瘤生长周期很慢，一周开始生长肿块，大约需要1~2个月才能长成肿瘤；
第二：可能是细胞状态差，活力不好，或是肿瘤细胞不易成瘤，需加入基质胶辅助或增大接种量或更换细胞系；
第三：一方面可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠）。
5.肿瘤体积相差很大，大小不一？
首先，并不是所有的肿瘤都能够长得均一形态。其次，这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导至，建议重新接种。