浓度梯度微流控芯片平台的构建及其应用于抗白念珠菌药物快速筛选研究（上）

微流控芯片

摘要: 本文建立了用于抗白念珠菌药物快速筛选的浓度梯度微流控芯片平台，通过荧光示踪剂荧光素钠在芯片上的分布定性考察浓度梯度生成情况，采用HPLC法对芯片内模型药物氟康唑的浓度梯度分布进行定量分析，进一步比较不同流速条件对浓度梯度形成的影响，最终确定两水相流速1:1的比例用于后续药物筛选研究。以阿尔玛蓝为细胞活力指示剂，通过该平台分别进行了两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、特比萘芬、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净的药敏实验，快速高效地获得了药物的MIC范围，且与CLSI建议的白念珠菌敏感株的MIC值相一致，表明该平台可以通过一次实验快速筛选得到抗菌药物的MIC值范围。此外，该批次白念珠菌对特比萘芬呈现耐药，与96孔板法验证结果一致，表明该方法还可以用于耐药菌株的快速筛选。

随着疾病谱和病菌谱的扩展, 临床上对抗真菌药物(以白念珠菌为代表)的需求愈加迫切。白念珠菌(Candida albicans)是一种机会性致病真菌, 通常共生于健康个体中, 对机体不产生侵害, 但偶尔会引起健康个体的黏膜(口腔/阴道)表面感染, 极少数情况下会引起皮肤或指甲的感染。但是, 在免疫功能低下的宿主中它可能引起危及生命的系统性和血液性感染, 死亡率高达50%, 它是严重真菌感染以及医院感染的常见原因。临床高发病率、致死率与耐药率促使找寻新药的脚步不断加快。当前对于抗白念珠菌药物的筛选主要基于96孔板, 采用美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)建立的最新标准M27-A3中的微量液基稀释法进行。然而, 传统孔板法需要配制不同浓度药物溶液, 需要细胞铺板、给药、标记等一系列繁杂费时的操作过程, 所以亟需建立更快速的抗真菌药物筛选新方法。

微流控芯片的通道尺度多是微米级, 雷诺数很小, 液体处于层流状态, 两种或多种不同试剂能够保持各自流型不变流入同一通道, 只在相与相接触面上发生分子扩散或反应。基于层流扩散和混合原理, 目前出现了很多浓度梯度微流控芯片, 这些芯片形成的浓度梯度具有较高的稳定性和重现性, 且通过改变通道构型设计、流体进样流量比、初始浓度设置以及组合顺序, 可以获得一系列复杂的浓度梯度, 简化了繁杂的操作过程, 显著减少了细胞和试剂消耗量, 同时可以进行高通量筛选。该技术目前已广泛应用于细胞培养、模式生物趋化、基因分析、药物筛选等研究领域。

课题组在前期研究中, 通过液滴微流控芯片所生成的液滴, 水相由单一成分组成, 一次实验通常只能考察一种实验条件, 为了提高药物筛选的通量, 本研究在课题组前期工作的基础上, 在水相引入了浓度梯度生成器, 自行研制了一种浓度梯度液滴微流控芯片作为筛选平台, 以阿尔玛蓝作指示剂, 分别测试了氟康唑、两性霉素B、特比萘芬等临床常用抗真菌药物的活性, 并采用孔板法验证该方法的可靠性与适用性。

材料与方法

菌株  白念珠菌SC5314菌株由海军军医大学药学院新药研究中心提供。

仪器   微量推拉注射泵、四通道单推注射泵, 1倒置显微镜、体视镜、Olympus DP73数码彩色照相机, ORCA-Flash 4.0 LT C11440-42U数字CMOS相机, Kylin-Bell Vortex-5旋涡混合器, 爱国者数码观测王GE-5, HZ-2111K-B恒温振荡器, Infinite M 200多功能酶标仪。

药品与试剂  卡泊芬净、5-氟胞嘧啶、特比萘芬(纯度均 > 98%), 氟康唑(≥98%)、两性霉素B (80%)。SU-8 3025光刻胶, 硅单面抛光片和显影液, SYLGARD®184 PDMS预聚体和固化剂, HFE-7500、Scotch隐形无痕胶带, 全氟化聚醚-聚乙二醇嵌段高分子表面活性剂(PFPE-PEG block-copolymer surfactant, EA-surfactant) 。阿尔玛蓝, 蛋白胨、琼脂、酵母浸膏, 葡萄糖, NaOH、NaHCO3等无机盐, 苋菜红染料粉末。所有化学试剂除特殊说明外均为分析纯。

储备液配制  阿尔玛蓝溶于纯水中配制成10 mg·mL-1的储备液, 4 ℃避光保存。氟康唑、两性霉素B、卡泊芬净、5-氟胞嘧啶、特比萘芬、伊曲康唑、伏立康唑和泊沙康唑溶于DMSO中分别配制成3.2、0.8、0.8、6.4、3.2、3.2、3.2和3.2 mg·mL-1的母液, 储存于-20 ℃冰箱备用。

培养基配制  沙堡葡萄糖琼脂(Sabouraud dextrose agar, SDA)固体培养基:蛋白胨10.0 g、葡萄糖40.0 g、琼脂18.0 g, 加入三蒸水900 mL溶解, pH值用NaOH调整至7.0, 三蒸水定容至1 L, 高温高压灭菌后在超净台内倒出适量于培养皿中, 紫外照射待凝固后, 倒扣于超净台内吹干上盖的水珠后储存于4 ℃备用。酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose, YPD)培养基:酵母浸膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、葡萄糖20.0 g, 三蒸水定容至1 L, 高温高压灭菌后分装, 4 ℃储存备用。

白念珠菌的培养  从-80 ℃冻存的菌株中挑取少许于YPD液体培养基中活化, 30 ℃、200 r·min-1振荡培养24 h后, 吸取10 μL于新的1 mL YPD液体培养基中, 继续在30 ℃、200 r·min-1振荡培养16 h, 用SDA固体培养基划板, 30 ℃培养48 h, 待长出大量单克隆菌落后, 4 ℃储存备用。实验时挑取SDA平板上的单克隆菌落于1 mL YPD液体培养基中, 30 ℃、200 r·min-1振荡培养16 h, 使其处于对数生长后期用于后续实验。

菌悬液制备  将培养至对数生长后期的菌液转移至离心管中离心去上清, 并用PBS缓冲液洗涤3次去除残余培养基, 然后将细胞重悬于1640培养基, 计数后调整菌液至实验所需浓度。

浓度梯度微流控芯片的设计与制作  采用AutoCAD 2015软件进行芯片结构设计, 芯片掩膜二维设计如图 1。芯片含两个水相入口、两个油相入口、四个出口, 浓度梯度生成器采用经典的“圣诞树”结构, 其形成浓度梯度的机制是基于微通道的层流的扩散混合效应, 芯片主通道宽设计为100 μm, 高为45 μm, 流体在通道内呈现层流特性, 并在蛇形微通道内发生快速混合与扩散传质形成浓度梯度。T字形流动聚集处宽为20 μm。芯片采用标准软光刻技术制作而成。

浓度梯度表征  为了验证芯片是否形成了浓度梯度并找到通入溶液的最佳流速, 采用染料荧光素钠和苋菜红对芯片的药物浓度梯度进行定性表征, 并通过HPLC对药物浓度定量从而对芯片的药物浓度梯度进行定量表征。

染料定性表征浓度梯度  选用50 mg·mL-1苋菜红溶液和20 μg·mL-1的荧光素钠水溶液作两种水相, 结合课题组前期对液滴微流控芯片研究成果[22]与该芯片系统使用条件的考察, 水相流速在80~120 μL·h-1时能够形成尺寸均一、大小适宜的液滴。因此, 实验考察两水相流速分别为100/80、100/100、100/120 μL·h-1的条件下, 芯片浓度梯度形成情况以及液滴生成形态, 并通过荧光显微镜采集通道内荧光图像。

HPLC定量表征浓度梯度  选用氟康唑进行芯片药物浓度梯度定量表征, 参考2015版中国药典中氟康唑注射液的定量方法进行测定。

色谱条件   色谱柱为Inertsil ODS-3 (250 mm×4.6 mm, 5 μm)的色谱柱; 柱温40 ℃; 紫外检测器检测波长为260 nm; 流动相为乙腈-0.063%甲酸铵水溶液(20:80);进样量20 μL。

储备液和工作液配制  精密称取氟康唑对照品4.20 mg, 用流动相溶解定容至20 mL, 配制成浓度为210 μg·mL-1的溶液作为母液, 用流动相稀释至浓度为100、50、25、10、5和1 μg·mL-1的标准曲线系列工作液。

为了考察氟康唑药物在芯片内的四种浓度梯度生成情况, 将油相入口封堵, 水相则以空白流动相作为A相, 100 μg·mL-1工作溶液作为B相, A:B相流速比分别为1:2、1:1和2:1进样生成浓度梯度, 浓度梯度生成后直接在出口处收集30 min水相溶液, 将收集的溶液进行HPLC定量。

浓度梯度微流控芯片的系统考察   在芯片应用前, 对芯片系统的适用条件和液滴稳定性进行考察。根据课题组前期研究选用HFE-7500作为油相, 考察不同水相流速(40~100 μL·h-1)、油相流速(40~200 μL·h-1)以及流速比(1:1、1:2)下液滴生成情况, 以在较短时间内生成稳定且大小均一适中的液滴。将生成的液滴收集至离心管中, 从收集当天(0天)至第5天每天将其涂布于载玻片上观察其形态和尺寸以考察其稳定性。

液滴包裹白念珠菌考察  活死染色是一种常用的细胞标记的方法, 通过对液滴内的白念珠菌染色可以观察液滴内白念珠菌的分布情况。

两水相分别为菌液相和空白水相。菌液相按照试剂盒使用说明书用RPMI 1640培养基配制100 μL含活死染料的白念珠菌溶液(菌浓度为0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1)、空白水相为RPMI 1640溶液(无菌), 在水相流速为100 μL·h-1、油相流速为200 μL·h-1条件下, 生成浓度梯度并包裹形成液滴。

浓度梯度微流控芯片实验  分别配制含药水相溶液100 μL和含菌液水相溶液100 μL, 其中含药水相溶液包含药液、阿尔玛蓝(终浓度250 μg·mL-1), 含菌液水相溶液包含白念珠菌(终浓度0.5×103~2.5×103 CFU·mL-1)、阿尔玛蓝(终浓度250 μg·mL-1)。根据CLSI的M27-A3, 各待测药物的起始浓度分别为:氟康唑64 μg·mL-1、两性霉素B 16 μg·mL-1、卡泊芬净8 μg·mL-1、5-氟胞嘧啶64 μg·mL-1、特比萘芬32 μg·mL-1、伊曲康唑32 μg·mL-1、伏立康唑32 μg·mL-1、泊沙康唑32 μg·mL-1。设定无药阳性对照组(含菌)和空白对照组(无菌)。油相为HFE-7500 (含1% EA-surfactant)。用微量注射泵以100 μL·h-1的流速向芯片水相入口1引入抗白念珠菌药物、水相入口2引入白念珠菌, 以200 μL·h-1的流速向两油相入口引入油相, 采用多浓度梯度微流控芯片生成液滴后收集到灭菌的0.2 mL离心管内, 于30 ℃条件下孵育2 h, 取少量液滴涂布于载玻片显微镜下观察荧光情况。

孔板实验验证  分别以两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑、特比萘芬、5-氟胞嘧啶、卡泊芬净为试药进行十级倍比稀释, 在96孔板中进行药敏实验, 采用直接观察法判断实验结果。氟康唑的浓度为64~0.13 μg·mL-1, 伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑和特比萘芬的给药浓度为32~0.063 μg·mL-1, 两性霉素B的浓度为: 16~0.031 μg·mL-1, 5-氟胞嘧啶的给药浓度为8~0.016 μg·mL-1, 卡泊芬净的浓度为0.8~0.007 8 μg·mL-1, 菌的终浓度为(0.5~2.5)×103 CFU·mL-1。每种试药设两个复孔, 用于平行对照, 30 ℃培养箱孵育24 h后将孔板对光从孔板底部观察实验结果, 以孔内产生浑浊的前一个孔的浓度为MIC。

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