解决方案|293T细胞培养攻略

无锡耐思NEST

细胞基础信息
生长特性：贴壁
细胞简介：293T细胞是一种常见的哺乳动物细胞系，在被用作逆转录病毒的生产时会产生高滴度的病毒。
细胞特点
01.细胞贴壁能力比较弱
293T细胞是贴壁细胞，但其贴壁能力比较弱，容易出现明显的成片脱落现象。比如：运输低温及震荡、在室温条件下静置时间过长、添加的培养基或其他试剂温度过低、培养时细胞密度过高、细胞聚集时未吹散、加液吹打时触碰了细胞表面等。
若脱落现象不严重应将细胞尽快放回培养基继续培养，若出现大片脱落的现象需要收集细胞重新消化吹散再接种。
建议使用经TC处理后的培养器皿培养细胞，如NEST细胞培养瓶、NEST细胞工厂等。


02.细胞本身偏嗜酸性，培养基消耗较快
293T细胞在略偏酸性的环境下生长状态更好，在培养过程中需要时刻注意培养基的pH值。在细胞密度达到70%以上时，细胞培养基的消耗速度较快，需要时刻观察并及时换液。

03.细胞生长时聚集成岛
293T细胞生长时呈岛状聚集生长，会逐步向外扩散直到完全融合。

04.细胞聚集成团之后很难再吹散
293T细胞传代过程中一定要注意吹散细胞，同时接种的密度不可过高。密度过高容易使细胞抱团，导至难以再次吹散，会在培养器皿中形成类似于球状的聚集体贴壁生长。导至即使培养条件合适细胞也难以生长。
细胞培养
01.细胞冻存
随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等现象。所以我们需要在细胞购进时就进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，从而增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液并洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后移除。
5. 镜下观察，当293T细胞变圆且细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7. 将细胞离心，1000rpm，2min。
8.根据计数结果加入细胞冻存液重悬细胞，密度为3×10^6个/mL。
9. 将细胞重悬液分装进细胞冻存管，进行冻存。
10. 液氮气象保存24小时后建议复苏一管检测细胞存活率，细胞状态等，若细胞活性合格可长期保存，若细胞活性合格率低于80%建议重新冻存。
注：NEST生物样本库解决方案提供细胞冻存全流程产品，如NEST冻存管、NEST冻存液、NEST样本管理系统、NEST冻存架等。

02.细胞传代
1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 吸取干净原有培养基，加入3-4mL常温PBS轻轻润洗细胞10-20秒后舍弃PBS。
3. 加入适量胰酶，轻轻晃动细胞培养瓶使胰酶与细胞充分混匀，彻底消化细胞。
4. 当细胞间隙变大，但并未完全脱落时在细胞培养瓶中加入培养基，终止消化。混匀细胞，900rpm离心3-5分钟后舍弃上清液。
5. 加入新的培养基重选细胞并均匀分到新的细胞培养瓶中，静置培养。
6. 传代完成24小时后建议观察细胞并换液，以去除死亡细胞。 
注：NEST细胞培养瓶规格齐全，表面经过TC处理，细胞贴壁效果极佳。同时NEST已推出新品细胞培养基及细胞盐溶液（PBS），助力细胞培养。

03.细胞复苏
1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃原有细胞并对一开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40摄氏度。
3. 查看NEST样本管理系统的记录，根据记录从液氮气象中取出冻存的细胞，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 加入培养基中并混匀后转入细胞培养瓶。
5. 放回37摄氏度、3%二氧化碳和95%相对湿度的培养箱中培养。
6. 第二天观察细胞存活率。倒掉旧的培养基，加入新鲜培养基。
注：可使用耐思新推出细胞复苏仪替代原始细胞复苏过程，细胞复苏时间短，细胞存活率高。

Q&A
01.细胞密度如何计算
常用的细胞密度指细胞相对于最大生长密度的比值，贴壁细胞可以粗略的用细胞所占培养容器底面积百分比表示，即显微镜下观察培养容器底部，有细胞的区域占总区域的百分比值。这种计算方式优点是直观简便，但受限于单个细胞在不同的生长密度时所占用的培养面积不同，导至计算并不严谨。

02.培养过程中细胞碎片较多
细胞内的黑色颗粒是细胞外分泌泡以及细胞器的折光，这个属于细胞自身特性，无法清除也无法改变。而细胞对培养环境不适应、缺乏营养、渗透压有异常等均可能导至细胞内颗粒增加，建议适当改变培养条件。
细胞外的黑色颗粒为细胞碎片和细胞代谢产物，需要先舍弃原有培养基后用PBS润洗清除细胞碎片，加入新的培养基后继续培养。如果润洗无法清除细胞碎片，可以等细胞密度处在70-80%左右时消化处理细胞，终止消化之后混匀细胞，收集细胞悬液在900-1000rpm条件下离心3分钟，舍弃上清液。重悬细胞→离心→再重悬后将细胞悬液接种到新的培养瓶。第二次PBS重悬是为了去除碎片，如果碎片很多，建议用PBS多次润洗细胞。

03.细胞出现聚团现象
细胞传代过程中需要尽可能地吹散细胞，并在显微镜下确认细胞基本分散后再把细胞接种到培养瓶中。
优质的培养体系能有效避免细胞吹散后在贴壁时再聚团的现象， 也可以减轻细胞聚团后无法重新摊开生长的症状。
培养过程中轻微聚团可以稍微延长消化时间，让大团细胞块下沉后吸取上层的分散细胞进行传代。若聚团过于严重建议重新培养或者更换培养体系。