支原体污染细胞的表现和解决办法

科研实验

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]支原体直径约为 0.1-0.3 μm，具有变形能力，可透过常见过滤膜（0.22-0.45 μm），因此常规的无菌过滤方法不能将其去除，常用的抗生素也对支原体无效。培养条件没变，又没有明显的污染迹象（浑浊、pH等），而细胞生长突然变慢、状态变差、细胞边界变得模糊；更换新的培养液，细胞状态没有恢复，细胞形态异常（拉丝、铺展）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]注：支原体污染时细胞表现为长得不好，也不死亡，同时，培养基又是清亮的，时间长达一周也没有什么变化，这时基本上可以判断出是支原体污染了。

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解决方案：

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1）对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下（2）-（8）的方法。

2）用MRA处理：用支原体清除剂处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

3）用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

4）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

5）使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

6）动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

7）巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

8）使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。