免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是一种利用抗原与抗体之间的专一性为基础,广泛应用于研究蛋白质与蛋白质相互作用的经典研究方法。 原理
如果细胞内两蛋白(A、B)有直接或间接的相互作用时,那么在温和的裂解条件下获得的蛋白样品中加入 A 蛋白的抗体将A蛋白沉淀下来,在细胞内与A蛋白直接相互作用的B蛋白或与其间接相互作用的C蛋白能一起被沉淀下来。使用western blot检测沉淀中是否存在B或C蛋白来确定B或C蛋白与A蛋白的相互作用。 用途
1、检测A、B蛋白在体内是否相互结合 2、分离与A蛋白相互作用的蛋白复合物 优缺点
优点: (1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态; (2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响; (3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。
缺点: (1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用; (2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用; (3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。 步骤
一
细胞的铺板与转染
1、提前一晚将293T细胞铺板至6 cm皿中,铺板量以达到相应的转染试剂要求为准; 2、用各实验室相应的转染试剂将以下质粒组合转染两皿细胞:flag 空载+HA-B;flag-A+HA-B;每质粒2微克。 二
免疫沉淀
1、转染24小时后,收获细胞,每皿加入500 μL裂解液,收集细胞至1.5 mL EP 管中,在冰上超声破碎细胞; 2、超声好后,4℃,12,000 g,离心30分钟,取400 μL上清液用于免疫沉淀,80 μL上清用作总蛋白并加入等体积的2Ⅹ loading buffer; 3、将400 μL上清加入用裂解液清洗了3遍的beads中,加入0.3-0.5 μg flag抗体,4℃孵育 3-4 小时; 4、4℃,2,000 rpm,离心3分钟,去除未结合的液体,留下beads沉淀,用预冷的蛋白裂解液清洗沉淀3次,每次5分钟; 4、最后一次去除清洗液,往沉淀中加入60 μL 2Ⅹ loading buffer,和总蛋白一起在沸水中煮沸 15 分钟。 三
Western Blot 检测
通过 SDS-PAGE 分离样品,利用全蛋白样品作为对照,检测flag-A和HA-B蛋白是否发生结合。 注意事项
1、对于内源的Co-IP检测应该用10cm皿来培养目的细胞,并维持较好的生长状态; 2、如果该实验用于新蛋白的鉴定,应注意抗体重链和轻链的影响; 3、该实验不能确定蛋白之间的相互作用是直接还是间接的。
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