高效液相色谱法-基础篇

与光同辉

摘要


高效液相色谱法（HPLC）具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点，广泛应用于医药、环保、石化、食品、化工等行业，是现在分离分析的重要方法，本文着重介绍HPLC的工作原理、基本组成及高效液相色谱名词术语，使新学者快速了解高效液相色谱知识，在日常操作中理论与实践结合，确保HPLC的高效运行、快速分析。

1、HPLC工作原理


100多年前俄国植物学家Tswett(茨维特) 他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带，Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法，即现在的Chromatography(色谱法)。
色谱法是通过是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解、分配、吸附等化学作用性能的差异，当两相作相对运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作用力而达到相互分离，色谱法的本质是分离分析方法。
两相中的一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase)，一相是流动的，叫作流动相(Mobile Phase)，又叫洗脱剂。用液体作为流动相的，即为液相色谱(Liquid Chromatography, LC)。



HPLC为High Performance Liquid Chromatography的缩写（High高、Performance性能、Liquid液体的、Performance 色谱），是一种区别于经典液相色谱，基于仪器方法的高效能分离手段，具有高压、高效、高速、高灵敏度、高选择性等特点。

2、HPLC分类


按固定相和流动相的相对极性分为正相色谱(NormalPhaseChromatography)和反相色谱(Reversed Phase Chromatography)。

正想色谱：固定相的极性大于流动相。

反相色谱：固定相的极性小于流动相。

有机化合物极性是指分子间作用力(静电引力、偶极力、色散力、氢键力)综合表现的一种表述。
从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。

按分离过程的机理分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和体积排除色谱。

吸附色谱(Absorption Chromatography)：根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离。

分配色谱(Partition Chromatography)：分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同。

离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography)：根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC)。

体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography)：分为GPC和GFC。

GPC(Gel Permeation Chromatography凝胶渗透色谱又称尺寸排阻色谱)：固定相是疏水性凝胶,流动相是水或缓冲溶液-有机溶剂。

GFC(Gel Filtration Chromatography凝胶过滤色谱又称水系凝胶色谱)：固定相是亲水性凝胶,流动相是水或缓冲溶液。
3、HPLC组成


HPLC由溶剂输送系统（脱气机、高压泵等）、进样系统（定量泵、六通阀、定量环、进样针等）、分离系统（色谱柱等）、检测系统（检测器等）、记录及数据处理系统。



高压输液泵：将流动相在高压下连续不断地送入液路系统，具有有足够的压力，输出流量恒定、可调，输出压力平稳，泵室体积小，泵体抗腐蚀、耐酸等特点。
压力平稳、流速恒定是HPLC系统稳定、重现性良好的前提条件，多数的HPLC故障、色谱数据异常均会表现出压力异常，如偏高、偏低、波动大等，在日常使用中需要特别关注压力变化。



在线脱气机：四元低压系统属于泵前混合，由于在常压下混合，极易产生气泡，必须配有在线脱气机，并要求流动相使用前进行脱气，流动相脱气得目的如下：

使色谱泵输液均匀准确，减小脉动。

提高保留时间和色谱峰面积的重现性。

防止气泡引起尖峰。

使基线稳定，提高信噪比。

降低溶剂的紫外吸收本底。

减少死体积。

防止填料氧化。



进样系统：分为手动进样系统和自动进样系统， 主要由定量环、六通阀、进样针等部件组成。手动进样系统的定量环用于准确定量，分为5μl、10μl、20μl等，需要根据不同进样量选择合适的定量环；自动进样系统仪器自带定量环多为100μl，如进样量大于定量环体积需咨询相应仪器工程师更换定量环及计量泵等，六通阀是最理想的进样部件，由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成，通过阀切换保证恒定的流速。