一杯奶茶的时间学会核糖核酸酶保护实验

科研实验

核糖核酸酶保护实验（Ribonuclease protection assay，RPA）基本原理是将标记的特异RNA探针(32P或生物素)与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化。

对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号; 对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素－辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。

与Northern杂交相比，核糖核酸酶保护实验灵敏度更高；由于没有PCR扩增的步骤、避免了PCR扩增造成的偏移，可以更准确的反应RNA的丰度；在一个反应体系中可以同时检测多个指标。

完整的RPA实验包括探针的制备/标记、杂交、RNaseA 消化、变性聚丙酰胺凝胶电泳和信号检测等步骤。具体操作如下：

一、探针的制备/标记

探针的制备一般使用体外转录的方法进行。

1.载体构建及PCR

构建含有探针序列的质粒。

设计含有T7或SP6启动子的PCR引物，注意：PCR产物是探针的模板，所以启动子序列在下游引物中。

2.体外转录

利用体外转录体系，以PCR产物为模板，合成探针。常用的体外转录体系如下：

4 ul  5倍转录缓冲液

2 ul  0.1 M DTT

4 ul  2.5 mM NTP（A，C，G）

0.8 ul RNA酶抑制剂（25 U/ μl）（Promega）

100 μM 标记UTP（32P）

1 ul RNA聚合酶SP6，T7或T3

总体积 20 ul。

孵育1小时，37℃。

二、杂交

1.探针纯化

可以使用QIAGEN公司的QIAquick核苷酸去除试剂盒或Boehringer离心柱（G50葡聚糖凝胶）进行。

2.杂交

RNA提取后溶于杂交缓冲液，调整浓度为1μg/μL，8μL RNA中加入2μL探针，95℃变性5分钟，40-55℃孵育4小时（孵育温度根据探针的溶解温度确定）。

3.消化

1)加入RNAse消化液，37℃保温30分钟。

2)加入10%的SDS10μL，蛋白酶K（10μg/μL）20μL，37℃保温10分钟。

3)苯酚-氯仿抽提，取上清。

4)异丙醇或无水乙醇沉淀RNA。

5)洗涤、溶解沉淀。

三、聚丙酰胺凝胶电泳

电泳方法同常规的SDS-PAGE电泳。

四、检测

放射自显影检测。

注：探针也可采用非放射性标记（如：生物素标记），那么随后的检测也需要按照非放射性标记的流程进行。

在一个反应体系中使用了6种探针，3种不同的实验方法进行实验，每一种方法重复3次（Tam Thuan Nguyen , Jeffrey B Smith.2002）