实验技巧 | 实时荧光定量PCR实验数据分析

与光同辉

实时定量PCR也被称为实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)，是一种在DNA扩增反应中加入荧光基团，以荧光信号积累实时监测每次PCR循环后产物总量，进而对待测样品中的目的序列进行定量分析的方法。


基本原理


在学习实时定量PCR数据处理之前，我们首先需要了解一下它的数学原理，Ct值为什么是我们数据处理过程中的一个关键的因素。这两个图显示的是实时定量PCR的一组结果。上图是原始的线性图谱，下图则是处理过的指数图谱，但是它们两者表示的是同样的意思。x-轴表示PCR 循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，也就是扩增产物的量。这个图中有基线、阈值、Ct值这几个概念，从这几个值我们能够最终得到模板中目的基因的含量。



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（1）那么什么是基线？如红色框所指，基线就是扩增曲线中的水平部分。在反应最初阶段，虽然产物是指数级增长，但是由于总量太少，其荧光处于背景水平，检测不到荧光增加。因此基线信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。然而当累积了足够的扩增产物，足以产生可检测的荧光信号时，这个信号的值就被称为阈值，如红色箭头所指。通常阈值默认为基线信号的标准偏差×10。在阈值的前后，PCR的反应仍然是指数级增长的，因此此时的PCR结果可靠，可以准确地反映体系中模板的初始量。Ct值是信号强度达到阈值时所需要的循环数，也就是扩增曲线与阈值的交叉点，如图中的红点所指。



（2）我们可以看到图的右边显示了扩增曲线的4个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期和平台期。其中在基线期和指数增长期，扩增产物都是以指数级增长的，但是在基线期我们没有办法检测；而到了线性期和平台期之后，由于不同基因，或者不同条件下其扩增效率差别很大，因此没有办法计算模板的含量。因此，在指数增长期的Ct值就成为了计算模板含量的一个关键值。



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（3）那么，为什么知道了Ct值就能够得到最初的目的基因含量呢？图中表示一个基因的单次反应扩增曲线。上面这个公式计算的是扩增产物的分子数N，它等于模板的分子数乘以1+扩增效率的n次方，n代表循环次数。也就是说，如果扩增效率为100%，产物分子数就等于模板数乘以2的n次方。但是显然，在线性增长期和平台期，扩增效率不可能是100%，因此上述PCR理论方程只在指数期成立，也就是绿色框的部分。

数据处理


1、这里的三张图片分别展示了我们在做荧光定量PCR时提到的三个名称：扩增曲线，标准曲线，熔解曲线。



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（1）扩增曲线：扩增曲线有两种展现形式，一种是线性，一种是对数形式。我们通常是用CT 来推算样品中样品的浓度。CT 值越高说明模板浓度越低。上面也详细说明了原理，在这里就不过多赘述。



（2）标准曲线：将已知浓度的样品（标准品）经过梯度稀释后分别取样进行荧光定量PCR，得到的一系列的Ct值，用这个Ct值与Log模板数对应可以得到一个相关的曲线，我们叫标准曲线。可以用这个标准曲线中的一些参数来判断这个荧光定量PCR体系的优劣。



（3）熔解曲线：Tm值，Melting Temperature（解链温度），PCR双链产物的退火温度。这两个图是在荧光定量PCR结束后，对产物进行逐步升温时进行的监测，可以看到在达到其解链温度时，荧光信号会有一个忽然的下降。我们将测得的这个曲线叫做熔解曲线。理论上如果PCR得到特异性产物则只有一个Tm值，在溶解曲线上表示只有单峰存在。如果是多相峰，那么可以判断产物不是单一的，发生了非特异扩增。



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2、绝对定量：用于确定未知样本中某个核酸序列的绝对量值，即通常所说的拷贝数。绝对定量需要已知浓度的模板来建立标准曲线。绝对定量在我们的实验中不常用，所以只简单介绍一下。是通过样品的CT 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。



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3、相对定量：是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异，也就是倍数差异。



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以上图为例，分析结果是在试验组和对照组中某一个靶基因的相对比率，即倍数差异。





进行相对定量可以以质量单位或者是参照基因作为标准，但是以参照基因作为标准的做法更加普遍，也更加方便，因此只介绍后者。用参照基因的优点是，这个方法能准确量化模板中的靶基因含量，尤其是当模板难以获得时，进行相对基因表达分析实验十分方便。但前提是我们必须要找到在不同状态中恒定表达的基因，而且它的表达水平不受样品处理方式的影响，比如热刺激，菌诱导等。