贴壁细胞培养的常见问题及解决方案

无锡耐思NEST

01贴壁细胞培养，细胞不贴壁

可能原因：胰蛋白酶消化过度；支原体污染；培养基pH值过碱（NaHCO3分解）；细胞老化；接种细胞起始浓度太低或太高。

解决方法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度；分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物；使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2；启用新的保种细胞；调节最佳接种细胞浓度。



02悬浮细胞成簇

可能原因：培养液中含钙,镁离子；支原体污染；蛋白酶过度消化使得细胞裂解；DNA污染。

解决方法：用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻巧吹吸细胞获得单细胞悬液；分离培养物，检测支原体；DNasel处理细胞。



03培养细胞生长缓慢

可能原因：由于更换不同培养液或血清；培养液中一些细胞生长必须成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏；培养物中有少量细菌或真菌污染；试剂保存不当；接种细胞起始浓度太低；细胞已老化；支原体污染。

解决方法：比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验，让细胞逐渐适应新培养液；换入新鲜配置培养液，或补加谷氨酰胺及生长因子；用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物；血清需保存在-10到-20℃。培养液需在2-8℃避光保存。含血清完全培养液在2-8℃保存，需在1周内用完；增加接种细胞起始浓度；换用新的保种细胞；分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。



04培养细胞生长不好

可能原因：

Ø 细胞本身的状态

细胞传代次数多，细胞老化；
细胞的接种量：接种量过低，细胞生长缓慢；
细胞传代时间过晚：细胞中毒，影响传代后的细胞生长；
胰酶消化时间过长或过短：时间过长，细胞死亡；时间过短，细胞未完全分离而成团，细胞死亡；
细胞的冻存与复苏：慢冻速溶。

Ø 污染

支原体污染；
霉菌污染。

Ø 培养基或血清

更换血清或培养基之前未进行验证；
选择的培养基是否合适；
培养基配制是否合适；
培养基配制是否准确无误。

Ø 培养环境

CO2供应是否正常；
培养箱或摇床温度控制是否正确。

解决方法：根据以上四个方面的可能原因，做出针对性的解决方案
Ø 注意细胞的本身状态：如传代次数，接种量等：
Ø 避免产生污染（用正规，合法，可朔源的血清）；
Ø 要用合适的血清或培养基，最好经过验证；
Ø 注意实验室的环境。



05培养细胞死亡

可能原因：培养箱内无CO2；培养箱内温度波动太大；细胞冻存或复苏过程中损伤；培养液渗透压不正确；培养液中有毒代谢产物堆积。

解决方法：检测培养箱内CO2；检查培养箱内温度；取新的保存细胞种；检测培养液渗透压；换入新鲜培养液。