细胞污染，你能做的那些事儿

无锡耐思NEST

在细胞培养过程中，凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为细胞污染，轻则实验结果出不来，重则祸及他人（实验室），前期投入的人力、物力、财力和长期的坚持都付诸东流。细胞污染不能完全被消除，但能减少其发生的频率和后果的严重性。

一旦发现有细胞污染，我们该做些什么？

一、判定细胞污染类并处理

常见的细胞污染细胞培养中最常见污染的是细菌、真菌、支原体和黑胶虫污染，判断细胞是否污染的一种简单方法是观察培养基。我们将简要介绍几种常见的细胞污染类型及处理方法。

01细菌污染

特征：

◆ 细菌污染时细胞培养基可能在4-6小时呈现混浊。

◆ 有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起。

◆ 在显微镜下呈黑色细沙状，或背景有大量黑点。

细菌污染可能造成细胞增殖缓慢或形态上的改变（多角、多核等），胞质中产生空泡、细胞漂浮凋亡。

处理方法：

抗生素	作用对象	使用比例	储存条件
卡那霉素溶液	细菌（如G+、G-、支原体）	稀释:1:100	-20℃
硫酸庆大霉素溶液	细菌（如G+、G-、支原体）	稀释:1:1000	AMB(15-30℃)
青链双抗	细菌（如G+、G-）	稀释:1:100	-20℃
青链双抗，10浓缩液	细菌（如G+、G-）	稀释:1:1000	-20℃
青链霉素制霉菌素三抗	细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释:1:100	-20℃
青链霉素两性霉素B三抗	细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释:1:100	-20℃
青链霉素，新霉素三抗	细菌（如G+、G-）	稀释:1:100	-20℃

轻度细菌污染可用10X双抗清洗处理，重度细菌污染建议消杀后丢弃。

02真菌污染

特征：◆ 真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑。◆ 霉斑往往会漂浮在培养液表面，随着时间逐步扩大。

念珠菌

◆ 有些真菌呈类似棉花絮状的漂浮物。

◆ 若是念珠菌会呈卵圆状，在细胞周边生长。

根霉菌

◆ 早期并不会使得培养基变黄变浑浊，但在显微镜下可观察到菌丝体。真菌形成的菌丝呈丝状，管状，树枝状，串珠状。

酵母菌

◆ 酵母菌等，当其行出芽生殖时可从一大一小的连体结构识别。

◆ 细胞被污染后，仍可生长，长时间细胞的活力状态会变差。

◆ 梅雨季时的污染率会提高。

◆ 呈卵圆状酵母菌增殖到一定规模，形成团簇状的真菌群。

处理方法：

抗生素	作用对象	使用比例	储存条件
两性霉素B	真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释:1:1000-1:10,000	-20℃
制霉菌素	真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释:1:100-1:1000	-20℃
青链霉素制霉菌素三抗	细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释: 1:100	-20℃
青链霉素两性霉素B三抗	细菌（如G+、G-）、真菌（如：酵母菌、霉菌）	稀释: 1:100	-20℃

细胞真菌污染较难根除，不建议保留，建议消杀后丢弃。

03支原体污染

最小的微生物，无法通过光学显微镜看见，但可通过电镜观察到。

感染支原体的细胞，在某一时间点碎片突然增多，随着传代，细胞状态显著变差。

细胞支原体污染可通过气溶胶传播，影响同一细胞房其他细胞。

特征：

◆ 增殖减慢

◆ 上清液清澈

◆ 背景干净

◆ 细胞形态异常（拉丝、铺展）

◆ 更换新的培养液，细胞状态没有恢复

鉴定方法：

PCR法、显色法、荧光染色法等。

示例1►EBTr (牛胚气管细胞)

感染支原体的EBTr (牛胚气管细胞)（成纤维样）

感染了支原体的EBTr特征：

1.由成纤维样逐渐变得类上皮样；

2.质膜铺展，溃烂；

3.轮廓不清，边界模糊；

4.凋亡细胞过多。

示例2►HT1080 (人纤维肉瘤细胞)

被支原体“附身”的HT1080
甩掉支原体的HT1080

感染了支原体的人纤维肉瘤细胞特征：

1.由上皮样逐渐变得类成纤维样，胞体细长；

2.伪足伸长，出现明显的拉丝现象。

处理方法：

◆若细胞污染后状态尚可，添加支原体抑制剂培养2-3代可转阴

◆ 若细胞污染后状态很差，建议消杀后丢弃。

04黑胶虫污染

“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代，是一种异养生物。

特征：

镜下无法直接观察到。主要表现为细胞状态差，黑点和碎片多，布朗运动。通过检测发现主要为细胞支原体污染，部分为未知的增殖不明显的微生物污染。

处理方式：

◆ 若细胞污染后状态尚可，添加黑胶虫抑制剂/支原体抑制剂培养2-3代可转阴

◆ 若细胞污染后状态很差，建议消杀后丢弃。

二、改善个人操作及培养环境

01清洁培养箱

发现细胞污染不能只处理这一个培养皿，还得看看这个恒温培养箱里其他培养皿或孔板里的细胞是否污染。

如果有而且好几个板子都有类似的污染块，那很可能是培养箱中的水或者空气污染了，得给培养箱做个大扫除，重新酒精消毒，照紫外；孵箱里的水，不仅没了得加还得记得十天半个月的就用酒精擦擦托盘。

02整理洁净台

超净台不是储物箱，什么培养皿、各种规格的板子、枪头不要堆在超净台，会造成许多紫外线顾不到的卫生死角。

细胞房其他的桌面，同样切忌东西堆积如山，不要将酒精棉球、标签纸、牛皮纸买来后全部堆在细胞房，污染物一不小心“飘”进你的细胞培养板里，细胞就会死给你看！

03严格无菌操作

细胞房这种卫生要求高的地方，人一旦多了救护增加许多不确定因素，难以保证试验在无菌条件下操作。出入试验室，实验服当风衣穿，不扣纽扣，不戴鞋套，犹入无人之境，来去自由；超净台做实验时，喜欢说话聊着做试验，殊不知你喷口气，里面就有很多细菌。

规范操作是避免污染的最有效方式。

细胞培养间配备枪式移液器、手术器械、离心机、冰箱等专用仪器设备以及专用的实验服和拖鞋，并定期消毒。

专用物品只在培养间内使用，不得带出细胞房。无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞。必要物品可暂时放置，其他实验用品用完即应移出，以利于气流的通畅。

培养细胞过程中使用的所有实验用具，如移液管、一次性枪头、一次性塑料离心管、冻存管等需121°C高压灭菌20分钟后烤干备用，一些玻璃器皿如细胞培养瓶等须先泡酸、洗净、晾干后再高压灭菌。