微流控技术在病原体快速鉴定和药敏检测中的应用与面临的问题

微流控芯片

目前临床微生物的检测以传统培养法为主，通过样本接种、培养，分离单菌落后，通过形态、生化反应或质谱鉴定菌种，进而通过纸片法、E-test或微量肉汤稀释法获得药敏结果。这种传统培养-鉴定-药敏的方式，虽然结果可靠，微生物实验室的“金标准”，但手工操作复杂、出结果时间长，人工成本和时间成本成为了微生物发展的重要制约因素。难以做到入院常规筛查病原体，易导至漏检，且感染患者也难以动态监测治疗效果；临床重症患者通常只能经验用药，在2-3天获得病原学依据后再按需调整抗生素，易导至用药无效、诱导耐药、过度医疗等情况，患者增加医疗花费，造成较大的社会和经济负担。

反观临床生化实验室，在20世纪80年代时也是手工单样本操作，但20世纪90年代以后，临床开始应用生化流水线，样本检测效率极速提升，出现了质的飞跃，大大促进了检验发展进程。而临床微生物领域的检测场景，目前仍需大量人力和时间，那么是否能如生化实验室一样，达到自动化检测水平？哪种检测技术具有病原体快速鉴定和药敏的优势？又能兼顾高敏感性和特异性？对于微生物检测而言，快检的主要关键问题在哪个环节？以上均是微生物实验室面临的挑战，也是需要回答的问题。

临床微生物实验室有哪些快速病原体鉴定和药敏的检测技术？微流控技术的优势是什么？  

理想的检测技术应包括几个层面：快速、精准、自动化、能够获得表型药敏等。在鉴定方面，目前微生物实验室可以进行快速病原体鉴定的技术，除传统方法外，还包括PCR、基于免疫的检测、荧光原位杂交、微流控芯片技术等。各方法的比较见下表1。

在药敏方面，近年出现了各类新兴的快速药敏检测方法，包括细菌纳米运动检测技术、流式细胞技术、表面增强的拉曼光谱法、单细胞形态分析技术、流式细胞分析法、DNA微阵列、多重芯片技术、PCR/real-time PCR、基因组测序等，见表2。但以上分子类的方法仅能检测药敏基因型，不能检测药敏表型，而基因型是否与表型一致，还需进一步验证；其他药敏表型的诊断技术，一般又需分离纯菌落测定，使检测时间延长。

综上比较，微流控技术不论在鉴定抑或药敏方面，均具有较明显的优势。可应用样本同时进行病原体的鉴定和表型药敏，可3h内完成测定；操作具有便捷性；目前该技术虽未完全实现自动化，但自动化已在发展进程中，也已出现了掌上微流控设备，达到一体化前处理、鉴定和药敏的目的。对于低浓度菌量的问题，通过微流控捕获使细菌富集，可达到体系检测阈值，具体在后文阐述。

微流控技术通过什么原理进行检测？

电化学微流控技术，应用生物传感器进行病原体检测。优势是结合“基因型+表型”共同特点，不需基因扩增，检测细菌16sr RNA鉴定病原体，拥有分子检测的敏感性和特异性；并监测表型药敏结果。检测原理是：样本NaOH前处理使细菌裂解后，病原体核酸释放，结合于包被了探针的检测芯片，通过特异性捕获探针-病原体16sr RNA-特异性检测探针组合，形成“三明治”结构，其中检测探针上标记了荧光素的辣根过氧化物酶，在TMB（电子介质）作用下，氧化还原H2O2（反应底物），生成电子，可产生电信号大小与病原体含量呈正比，实现定量检测，在电流检测装置中，1分钟即可读取电流信号值1（图1）。16通道芯片，可根据靶点设计不同探针，同时进行多重病原体的检测。由于检测过程无需经过扩增，使整体反应和检测时间大大缩短，将鉴定时间，由传统培养法的18 h缩短为1 h，且操作便捷。

注：A图为检测芯片结构，芯片上包被各类细菌种属特异性捕获探针，与细菌16sr RNA、以及检测探针相结合，形成特异性捕获探针-16sr RNA-捕获探针复合物，即“三明治”结构。B图局部放大，显示此“三明治”结构在酶促底物作用下，生成电流，最终通过测定电流信号值大小，进行病原体种类和定量判断。

微流控技术为何能够获得表型药敏结果？

表型药敏是临床用于判断细菌耐药性的金标准，电化学微流控技术检测细菌16sr RNA，因16sr RNA是细菌生长复制活跃的标志，只有生长状态的细菌才能被识别检测，在该技术中呈现电流信号的变化。分析样本在抗生素作用下电流信号值的变化趋势，获得药敏结果。样本与待检测抗生素短时孵育，敏感菌株生长抑制、菌量减少；反之，耐药菌株的菌量呈增多的趋势。电流信号升高或降低的变化，即对应细菌生长或抑制趋势，明确细菌对药物的敏感性，检测的结果反应的是细菌表型生长特征。这类药敏检测兼具了16sr RNA探针基因的特异性，以及表型药敏的稳定性。

目前，电化学微流控体系也出现了荧光检测的整合平台，通过测定荧光信号强弱变化，明确表型药敏结果（图2）。通过荧光信号监测细菌生长，能够实现单细胞层面的药敏分析。

目前传统微生物药敏检测时间约为48 h，电化学微流控体系仅需短时与抗生素孵育后进行监测，不需分离纯培养物，可直接应用样本检测，将药敏时间缩短为3 h以内。

该微流控体系可检测样本实现单细胞层面的鉴定，并且进行表型药敏。将样本滴加在微流控装置中，加入探针并与抗生素混合。结合细菌16sr RNA检测靶点，测定荧光信号的探测器分析。通过分析对应的荧光信号强弱的变化，明确抗生素敏感性。  

微流控体系为何具有高敏感性和高特异性？

对于生物传感器的识别元件，微流控体系中采用核酸适配体（即16sr RNA核酸探针，结合细菌的16sr RNA片段），生成电信号，通过检测电流值大小明确信号强度。相比其他生物传感器识别元件，如抗体、抗菌肽、生物小分子及化合物、凝集素、分子印迹聚合物等，核酸适配体具有更高的特异性。

电化学微流控方法是一种分子诊断技术，即将标记了荧光基团的线性探针直接和细菌16srRNA杂交，产生电流信号。由于一个细菌内部存在大量rRNA（约103-105个），即无需扩增，也能保证反应的敏感性，这也是该技术直接可应用临床样本，不需分离纯菌株，即可进行特异性病原体鉴定的原因；也解释了为何不经扩增，即可达到普通PCR反应检测的敏感性。

但由于RNA稳定性较差，为提高探针的稳定性，将核酸探针更换为肽核酸探针，后者指蛋白和核酸的杂合物，这类探针可与DNA或RNA分子形成稳定的杂交复合体，由于既不是纯核酸也不是纯蛋白，因此该复合物同时具有抑制核酸酶和蛋白酶降解的能力，并具有热稳定性，也可增加杂交率。探针经修饰改良后，微流控体系同时具备了敏感性、特异性和稳定性。

微流控技术的临床应用如何？鉴定和药敏结果是否可靠？

微流控技术直接应用临床样本，进行样本中病原体的鉴定和药敏。现在已应用的临床场景包括尿路感染，血流感染等。

在鉴定方面， 16通道的芯片，可针对检测靶点设计不同特异性探针，能够同时鉴定并定量。应用尿液样本，对临床常见的肠杆菌，非发酵菌，肠球菌等测定。以传统培养法作为标准方法，对微流控技术检测结果比较，分析其敏感性为89%，特异性达到100%。对尿液样本检测限达到104CFU/ml，达到临床对尿路感染的诊断标准。针对模拟血流感染样本，对肠杆菌、葡萄球菌、非发酵菌等，同样可以准确鉴定。并且电化学微流控在1h内，即可获得病原体鉴定结果。

在药敏方面，直接与抗生素混合进行电流值的测定。多通道芯片可混合不同种类的抗生素，通过电流值的动态监测，同时获得多种抗生素，如青霉素类、喹诺酮类、磺胺类等的药敏结果（图3、图4）。应用临床尿液样本，以微量肉汤稀释法为标准方法，分析电化学技术对药敏检测的准确度，每种抗生素的准确性均达到90%以上，重大错误率为4%，极重大错误率1%，基本符合微生物性能验证标准（其中仅重大错误率略高于3%的标准）。微流控技术应用临床样本，3h即可获得初步表型药敏结果。

患者尿液与抗生素作用后形成的电流信号值，在无抗生素（紫线）、氨苄西林（红线）、环丙沙星（绿线）和复方新诺明（蓝线）药物中生长曲线。每15 min检测1次大肠埃希菌16sr RNA，电化学微流控的快速药敏结果和临床传统方法VITEK2 板卡的结果一致。AMP氨苄西林，CIP环丙沙星，SXT复方新诺明。

尿路感染患者临床样本，应用电化学微流控系统，进行快速病原体鉴定和初步药敏。结果显示，该样本为大肠埃希菌阳性，且浓度约为105cfu/ml；常用抗生素中，头孢类抗生素敏感。整个过程在3h内完成。

NC阴性对照，EF粪肠球菌，EC大肠埃希菌，KP肺炎克雷伯菌，PA铜绿假单胞菌，PM奇异变形杆菌，EB肠杆菌目，UNI泛指所有细菌。

POS阳性对照，SXT复方新诺明，CIP环丙沙星，AMP氨苄西林，AXO头孢曲松，GEN庆大霉素，EFP头孢吡肟。

快速检测的关键环节和面临的问题是什么？微流控技术是如何解决的？

关键环节之一是对样本的前处理，微流控技术应用化学法，即溶菌酶和NaOH裂解样本中的病原体，在8min内达到释放核酸的目的。已应用在临床尿液样本，以及血液样本的检测，并分别明确了其适用性。

其次，对于复杂样本，需充分考虑基质的影响因素。如血液样本，存在复杂的基质效应和背景；尿液样本中的PH值范围差异较大，呼吸道样本的黏性高，等等。如应用芯片和生物传感器进行检测，需要避免基质对检测的影响。通过模拟血流样本，应用微流控检测多种细菌，包括大肠埃希菌，铜绿假单胞菌，金黄色葡萄球菌等，通过分析电流信号值，明确对于全血的检测，背景值<25 nA，特异性靶点的检测，阳性阈值为100 nA，能够区分阳性信号，说明背景的基质效应，不影响微流控检测结果的判读。对于尿液检测，已通过100余例样本，明确敏感性89%、特异性100%，说明尿液PH值的差异性并非影响电流信号值的主要因素。

另外，对于菌量低的样本，如何富集细菌，达到技术的检测限也是难点之一。由于血液中菌量可低至1-10cfu/ml，而微流控装置测定菌量起始浓度范围是104-108CFU/ml，需通过前处理的富集，使检测限达到样本浓度的需求。对全血样本，通过葡聚糖沉淀红细胞，血浆再经离心，可20 min内快速富集血液中的细菌，达到即使血液中菌量浓度低至10cfu/ml，也可被微流控装置捕获，再次提高检测的敏感性。甚至通过微流控装置监测在抗生素作用下，单个细菌的生长状态，即可在1h左右即获得单细胞层面的表型药敏结果，使其能够达到血液感染样本低浓度菌量的检测需求（图5）。

单个大肠埃希菌在微流控通道中，分别加入不同浓度的抗生素。红色箭头指向细菌所在位置，在低浓度氨苄西林（<2 µg/ml）作用下，细菌生长；高浓度（8 µg/ml）时，细菌裂解。比例尺5 µm。

微流控技术结合了“基因型+表型”的优势，即获得分子检测的敏感性，同时获得表型药敏。这种术既满足了临床对检测时间的要求（1h可获得鉴定结果，3小时可获得药敏）；也满足了实验室对操作便捷的需求。可不经分离纯菌落，直接应用临床原始样本进行检测，将传统微生物鉴定时间，由18h缩短至1小时；将获得药敏的检测时间，由48 h缩短至3小时，且达到单细胞监测层面。拥有多通道的芯片体系，可多重检测，且逐步在实现自动化的检测进程中。微流控技术快速为临床提供病原学诊断依据，可提高临床诊治效率，降低血流感染患者病死率；同时通过减少不必要的抗生素花费，减少社会经济负担。未来可以充分发挥灵活设计的优势，继续探究该技术在真菌、分枝杆菌等其他病原体的检测的能力。

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