电化学发光免疫分析机理及其应用

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电化学发光免疫分析（ECLIA）是一种集电子发光技术、纳米微粒子技术、生物素-亲和素系统、抗原-抗体免疫反应、电磁场分离整合为一体的自动化标记免疫分析系统，是电化学发光和免疫测定的结合。ECLIA常用磁珠微球作为固相载体，三联吡啶钌[ Ru（bpy）32+作为发光物质，由电极激发，在三丙胺参与下迅速稳定发光，使检测结果稳定可靠，其精密度、准确度均优于酶联免疫法。ECLIA既具有发光检测的高度灵敏性， 又具有免疫分析的高度特异性， 整个反应过程在全自动化封闭体系中进行，无人为操作误差影响。ECLIA具有无放射性、灵敏度高、线性范围宽、操作简单、易标记、可实现在线分析等优点而备受关注，并且适用于对生物组织、体液等复杂生物样品中极低含量的生化物质及药物分析，因此在免疫分析研究中发挥着越来越重要的作用。

1. 电化学发光原理

电化学发光免疫分析包括了电化学反应和化学发光两个过程。二价的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+作为标记物，有标记物的生物分子与配体发生特异的结合反应后，进入流动测量室，此时电发光过程被启动。

1）电化学反应过程：在一定的电压作用下，[Ru（bpy）3]2+释放电子成为[Ru（bpy）3]3+，同时电极表面的三丙胺（TPA）也释放电子成为阳离子自由基 TPA+，并迅速自发脱去一个质子而形成三丙胺自由基TPA·；

2）化学发光过程：具有强氧化性的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]3+和具有强还原性的三丙胺自由基TPA·发生氧化还原反应，结果使[Ru（bpy）3]3+还原成激发态的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+*，然后它以荧光机制衰变释放出一个波长为620nm光子的能量，而成为基态的[Ru（bpy）3]2+；

3）上述化学发光过程后，反应体系中仍存在二价的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+和三丙胺（TPA），电极表面的电化学反应和化学发光过程可以循环进行。通过上述的循环过程，测定信号不断地放大，检测灵敏度大大提高，故电化学发光检测具有高灵敏的特点；

上述的电化学发光过程产生光信号的强度与[Ru（bpy）3]2+的浓度成线性关系。将[Ru （bpy）3]2+与免疫反应体系中的一种物质结合，经免疫反应、分离后，检测免疫反应体系中剩余二价的三联吡啶钌[Ru（bpy）3]2+经上述过程后所发出的光，即可得知待检物的浓度。

2. ECLIA在医学检测中的应用

1） 传染疾病病原体诊断

目前大多数实验室采用ELISA和胶体金法对病原体进行检测，但对于低浓度样本，检测时常因方法学的原因造成灵敏度低，导至临床出现漏检，并且由于影响检测的因素较多，尤其是灰区附近的样本测定结果差异大，导至重复性差。胶体金虽然操作简单，但灵敏度较低，临床漏检率相对较高。以艾滋病（HIV）检测为例，国内HIV感染的临床诊断以血清病毒抗体检测为主，运用ECLIA测定血清HIV的整个检测过程中是在封闭流动系统中进行，极大地降低了交叉污染，测定结果不仅快速、准确、可靠，完成单个样品分析时间也大大缩短，且特异性、精密度均优于ELISA并克服了钩状效应等假阴性现象，可批量上机进行自动化分析。

2） 蛋白质和激素检测

目前激素的检测多为RIA与ELISA，前者会造成生物损害及环境污染，后者的反应底物具有毒性且洁厕结果受温度和pH值的影响较大。用ECLIA替代RIA与ELISA可在避免上述危害的同时给临床诊断、治疗和预后提供可靠的实验数据。ECLIA可对甲状腺激素、性激素等多种激素进行测定，以糖尿病中的胰岛素为例，ECLIA可动态检测低浓度范围的胰岛素水平，相较于其他方法来说ECLIA是一种非常灵敏可信且没有放射污染的均质分析方法。

ECLIA测定血清肌酸激酶、肌钙蛋白、肌红蛋白和地高辛等，有利于诊断早期心肌梗死等心肌损伤性疾病；检测黄体生成素、促卵泡生成素、雌二醇、孕酮、催乳素、睾酮等，可利于诊断早期生殖系统疾病；检测胰岛素、胰岛素样生长因子，有利于糖尿病早期诊断；还可用于血清T3、T4、FT3、FT4等甲状腺激素的测定。

3） 肿瘤诊断

随着肿瘤基础理论的发展，新检测手段和技术大量涌现。肿瘤标志物在肿瘤诊治中的重要作用已被学术界所公认，目前主要用于肿瘤的早期发现，如前列腺特异性抗原（PSA）、甲胎蛋白（AFP）能用于普查无症状的肿瘤病人、肿瘤的鉴别诊断与分期、预后判断、疗效观测与判别复发的指标。ECLIA因其出色的灵敏度与无放射性污染在肿瘤标志物检测中逐步取代其它检测方法。

ECLIA可对良性及恶性肿瘤患者进行体外早期辅助诊断，可以免除肿瘤介入检查的高费用，同时还可针对检测血中的癌胚抗原和肿瘤相关糖蛋白抗原进行结肠癌、胃癌、胰腺癌等消化系统及卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌等妇科癌症的诊断。此外ECLIA还可检测血清HCG，适用于早孕和宫外孕诊断。

4） 检测细胞因子及基因

体内细胞因子种类繁多，但含量均较少，常规检测方法难以得到准确结果，运用ECLIA可以很好的解决这一不足。ECLIA可用于测定脑内衍生神经营养因子（BDNF）、神经营养因子（TNF），也可用于测定T细胞中γ-干扰素水平及血清、细胞培养液中多种白细胞介素的含量。

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