荧光素酶表达的淋巴瘤NCG小鼠模型的构建

与光同辉

淋巴瘤是发生在淋巴结及或淋巴结外淋巴组织的恶性肿瘤，可分为霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤，在青壮年中发病率比较高。据世界卫生组织统计，目前全球每年约有35万新发淋巴瘤患者，死亡患者人数超过20万。我国淋巴瘤发病率为0.02‰，每年新增患者约2.5万人，死亡2万人。淋巴瘤已经严重威胁人类健康，建立合适的动物模型是研制抗肿瘤药和了解血液肿瘤发展的重要手段。

动物的选择

NCG免疫缺陷小鼠为人源化小鼠模型，此品系缺失成熟的T细胞、B细胞和NK细胞，可以用来移植人类造血干细胞、肿瘤细胞。选用NOD-Prkdcem26Cd52（上标）Il2rgem26Cd22（上标）/Nju(NCG)免疫缺陷小鼠。

造模方法

1

表达荧光素酶慢病毒质粒的构建

以慢病毒质粒lentiCRISPRv2作为骨架载体，lentiCRISPRv2质粒原表达框架为cas9及共表达的嘌呤霉素，将表达cas9的序列通过分子生物学手段替换成表达荧光素酶的基因序列，即可得到荧光素酶与嘌呤霉素共表达的病毒包装质粒。对lentiCRISPRv2进行XbaⅠ和BamHⅠ双酶切去除cas9表达框，酶切产物进行1%琼脂糖胶跑胶回收10000bp处条带，利用Addgene设计引物lentiCRISPRv2-luc+-F(5’-GAACACAGGACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGAAGACGCCAAAAAC-3’)和引物lentiCRISPRv2-luc+-R(5’-GAAGTTTGTTGCGCCGGATCCACACGGCGATCTTTCCGC-3’)，以PLG-3 basic为模板，采用 PhantaMaxmastermixPCR扩增荧光素酶基因片段。ONEstepCloneKit(Vazyme)将lentiCRISPRv2胶回收产物和 PCR产物进行连接。连接产物转入E.coli DH5α大肠杆菌感受态，带氨苄青霉素的Luria-Bertani(LB)平板上筛选转化子，用引物lentiCRISPRv2-luc+-F 和lentiCRISPRv2luc+-R对转化子进一步筛选，并通过测序进一步验证，通过Snapgene进行序列比对，阳性克隆命名为lentiCRISPRv2-luc+。

2

慢病毒的包被、浓缩

HEK293T细胞常规培养于高糖DMEM培养基中，于37℃恒温，5%CO2的培养箱中培养。选择生长状态良好的HEK293T细胞，于10cm培养皿接种约4×1000000胞，12~16h后达到70%~80%融合率。在一个无菌的5mL试管中，加入无血清Opti-DMEM培养基1.5mL，依次加入12.5μg的lentiCRISPRv2-luc+、10μgVSVG和7.5μgΔ8.91 3种质粒，轻轻混匀。在另一个无菌的5mL试管中，将60μL聚乙烯亚胺(PEI)(1ng/μL)稀释于1.5mL无血清Opti-DMEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min。将稀释好的PEI缓慢加入混匀的质粒中，混匀，室温孵育20min，形成DNA-脂质体复合物，逐滴加入培养皿中，8h后换成完全培养基。收集转染后48h和72h的病清，4℃，4000r/min离心30min去除细胞碎片，并用0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞碎片；4℃条下，25000r/min超速离心2h，保留沉淀，利用RPMI1640培养基溶解沉淀即为浓缩病毒，将病毒分装，立即使用或冻存于-80℃备用。

3

慢病毒滴度的测定

实时荧光定量PCR(RealtimeQuantitativePCR，qPCR)法测定慢病毒的滴度，以lenti-luc+大抽质粒为标准品，测定标准曲线:利用阿佛加德罗定律推论，将lentiCRISPRv2-luc+逐级稀释成1010，109，108，107，106，105，104，103，100，10，0个拷贝等梯度浓度，每个梯度重复3次，设计引物:WPRE-F(5’-GGCACTGACAATTCCGTGGT-3’)和 WPRE-R(5’-AGGGACGTAGCAGAAGGACG-3’)，以逐级稀释好的质粒为模板，qPCR测定拷贝数和Ct值之间的相关性，并拟合成直线。吸取混匀的病毒，抽提病毒RNA，反转录成cDNA，以 WPRE-F和 WPRE-R为qPCR引物，测定Ct值，利用已经得到的标准曲线，计算出病毒拷贝数。由于病毒颗粒与病毒拷贝数一一对应，即可计算出病毒的滴度。

4

嘌呤霉素最佳筛选浓度的确定

取对数生长期Raji细胞，按每孔5×105个接种于6孔板中，置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。嘌呤霉素按0，0.5，1，1.5，2，3μg/mL设置6个浓度梯度。在细胞接种24h后，将配制好的嘌呤霉素加入96孔板中，每个浓度设置3个重复孔，每天观察细胞生长情况，在48h内全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为筛选表达荧光素酶的Raji克隆细胞的浓度。

5

慢病毒对Raji细胞的感染，阳性细胞

的筛选及扩增

取对数生长期的Raji细胞5×105接种于6孔板中培养24 h，加入浓缩后的病毒，以感染复数(MultiplicityOfInfection，MOI)=5感染Raji细胞，并加入终浓度为8μg/mL的polybrene，加入1mLRPMI1640完全培养基，37℃，5% CO2培养箱中静置感染24h后换成含10%胎牛血清的 RPMI1640新鲜完全培养基。继续培养24~48h，培养基变黄时，更换新鲜培养基。向慢病毒感染后72h的Raji细胞中加入合适浓度的嘌呤霉素，每两天更换一次培养基并维持嘌呤霉筛选直至得到阳性混合细胞。取1×10000个细胞加入荧光素酶底物，初步鉴定荧光素酶的表达；将嘌呤霉素筛选浓度提升到3倍，筛选荧光素酶高表达阳性克隆细胞，命名为Raji-luc+。

6

荧光素酶活性鉴定

将Raji-luc+细胞传代5~10次，收集一定量细胞，按梯度稀释于96孔板中，每孔 Raji-luc+细胞数分别为2×104，1×104，5000，2500，1250，625，312，0个，用荧光素酶底物(Promega)，酶标仪检测细胞发光情况，检测细胞发光强度和细胞数之间的相关性；进一步使用活体成像对每孔Raji-luc+细胞数分别为4×104，2×104，1×104，5000，2500，1250，625个及4×104个Raji细胞的96孔板成像。

7

NCG小鼠血液肿瘤模型的建立

随机将4~5周，体重15~20g，5只雌性NCG小鼠分成两组，空白对照(mock)组小鼠，实验组小鼠(n=4)每只尾静脉注射 Raji-luc+细胞1×106个。实验组取对数生长期的Raji细胞，用PBS重悬细胞密度为1×107/mL，实验组每只小鼠尾静脉注射100μL；mock组尾静脉注射100μLPBS，接种后第0d，9d，12d，15d，活体成像仪检测肿瘤成瘤情况。检测前使用戊巴比妥钠麻醉小鼠(计量为35mg/kg)，严格按照Promega说明书注射底物，10min内，进行活体成像分析肿瘤生长情况，并绘制小鼠体重变化曲线。

结果

01

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lentiCRISPRv2-luc+质粒的构建

以lentiCRISPRv2-luc+为载体骨架，将荧光素酶表达基因插入其中，转入E.coli DH5α大肠杆菌感受态细胞，获得阳性转化子。荧光素酶通过P2A与嘌呤霉素基因相连，EF1-α启动荧光素酶和嘌呤霉素的共表达。

02

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慢病毒滴度的测定

以lentiCRISPRv2-luc+质粒为标准品，稀释成每孔1×107，1×106，1×105，1×104，1×103，1×102，10，0个拷贝梯度浓度，每个梯度浓度重复3个孔，QPCR测定拷贝数对应的Ct值，分析拷贝数和Ct值成对数相关性，R2=0.9985，拟合成方程为:y=-1.535ln(x)+35.453，y代表Ct值，x代表拷贝数。抽取病毒总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，重复3个孔，测得 Ct为26.78，计算拷贝数为211，稀释倍数为1×105，计算出病毒滴度为2×107/mL。

03

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Raji阳性细胞的筛选和稳定表达荧光素酶的Raji细胞系的鉴定

经嘌呤霉素梯度浓度筛选，确定筛选Raji细胞的最佳嘌呤霉素筛选浓度为2μg/mL，慢病毒感染Raji细胞后经2μg/mL的嘌呤霉素筛选1周后，细胞不再死亡，开始正常生长；将嘌呤霉素浓度提升至6μg/mL，筛选出高表达荧光素酶的Raji细胞混合克隆，在含6μg/mL的RPMI1640完全培养基中继续扩大培养并传代，至第5代时利用荧光素酶活性检测。嘌呤霉素的筛选浓度从2μg/mL提升至6μg/mL，Raji细胞荧光素酶表达量提升约2倍，Raji-luc+细胞系荧光素酶的高表达有利于在小鼠体内灵敏的追踪肿瘤形成或消除。在96孔板中，用RPMI1640培养基将Raji-luc+细胞进行倍比稀释，从10000/孔到160/孔，用培养基作为阴性对照(mock)，加入荧光素酶底物，酶标仪检测和收集数据，发光强度与细胞数量成正比，可以依据发光强度的大小来判断肿瘤细胞的多少。取相同梯度稀释的细胞加入荧光素酶底物，最后一个孔为RPMI1640培养基，作为阴性对照。体外活体成像仪显示，Raji-luc+细胞具有良好的成像功能，当细胞数只有625个时，依然能检测到信号值，且从图像显示的亮度可以看出发光强度与细胞数成正比。

（活体成像技术是一种高灵敏度而直观的影像技术，能够准确地观察经荧光素酶标记的细胞体内定位、增殖及转移情况。其优势在于：荧光素酶标记的肿瘤细胞在小鼠体内成瘤后，利用灵敏的活体成像系统，检测荧光素的发光强度，可间接反映出小鼠体内肿瘤细胞的数量、大小和转移情况。因此活体成像技术是筛选抗肿瘤药物和评价抗肿瘤药物有效性的新兴手段。）