3D细胞培养：市场和产业需求（下）

微流控芯片

8. 微流体：提高生理相关性的宏观步骤

微流体依靠使用高度或宽度为10-100微米的小通道来处理少量流体。与其他更传统的3D细胞模型相比，它们的关键属性是它们能够更好地控制细胞、物理和生化微环境。这使研究人员能够重建复杂的细胞模型，更真实地模拟人体组织。
微流控芯片的设计可以由许多不同的通道或隔间组成，可以很容易地适应研究人员的需要。这种分区允许在生理长度尺度上对细胞分布进行独特的空间控制，特别是对于不同细胞类型的共培养。许多微芯片现在已经在微芯片上集成了电子和机械执行器，例如阀门或开关，这有助于在同一芯片上实现几个连续的步骤。这一概念通常被称为芯片上实验室：许多耗时的实验室任务可以被微型化并自动化到微流控芯片上。与传统的宏观分析相比，这种小型化还减少了所需试剂和细胞的体积，从而降低了成本。
通道的存在允许在生理长度范围内控制流量。这有助于跨通道形成化学或物理梯度(例如，细胞因子梯度或间质压力)，这在许多生物过程中是重要的。测定中流动的建立有利于介质的灌流，重建重要的生物力学过程，如剪切力，或简单地允许重建血流中细胞的流体环境。
最后但并非最不重要的一点是，微流控芯片中的细胞与显微镜物镜之间的距离较短，能够以比其他传统的体外宏观系统更高的分辨率成像整个样品。
与微芯片相关的一些重要限制：主要的限制之一是，如果需要进行后续测试，细胞很难取回。此外，即使检索到这些卷，其大小也可能不足以进行后续测试。然而，为了适应3D细胞培养市场的需求，即使是这些挑战也正在与其他挑战一起逐渐被克服。

9. 显微镜下3D细胞培养的未来
为了跟上药物发现和细胞治疗市场日益增长的需求，3D细胞培养面临着许多挑战。
第一个问题是重复性：通常情况下，3D细胞培养结果变化太大。这种可变性的来源有三个方面。第一个是生物学上的。众所周知，细胞和细胞衍生产品(如Matrigel或血清)在不同批次的生产中存在广泛差异。可变性的第二个来源是基于用户的：与3D细胞培养相关的许多程序，如移液，都是手动完成的，因此容易发生用户依赖的可变性。最后，许多方案可能会受到环境因素的影响，而这些因素在分析中往往不是本地控制的，例如温度或湿度，这可能会对3D凝胶聚合等关键步骤产生非常大的影响。与此同时，3D细胞培养程序远非易事。它们需要专业和训练有素的工作人员，而缺乏这些工作人员正在阻碍市场增长。此外，这些任务既耗时又昂贵。
这些问题都指向了3D细胞培养领域的两大需求：自动化和标准化。理想情况下，需要新的产品来促进这些3D细胞培养过程并减少人为干预，从而将人为错误降至最低，加快方案并提高吞吐量和重复性。细胞传代或细胞扩增等任务的自动化已经在进行中。
3D细胞培养领域的另一个主要瓶颈是缺乏方便的读数。太多的研究严重依赖3D成像来分析细胞形态、迁移或生存能力。这需要大量的时间和使用昂贵的专业设备，如共焦显微镜。尽管考虑到这些变量的信息量很大，这仍然是必要的，但也需要努力开发更容易的读数。与此同时，还需要努力标准化分析方法，以量化这些结果：重建3D图像远非易事。虽然商业上有几个3D重建软件包，但从这些复杂的数据集中定义、提取和量化新的变量仍然是困难的。

总而言之，我们预计这些方法学上的挑战将需要解决，以便在临床背景下促进3D细胞培养的流程化。这些技术进步有望帮助该领域朝着以下方向发展：血管化、类器官/iPS细胞、芯片上器官、个性化医学和免疫活性模型。
人们对血管化的细胞模型非常感兴趣。首先，这大大增加了它们与药物发现目的的生理相关性。事实上，许多疾病和生物过程与血管系统的存在、破坏或形成密切相关。例如，癌细胞在从原发肿瘤迁移并在远处器官中形成继发肿瘤时与血管系统发生严重的相互作用。在体外对血管系统进行建模也有助于通过血液循环重建药物输送。其次，出于细胞治疗的目的，血管化组织将有更高的机会长期植入患者体内。
正如前面所讨论的，另一个日益引起人们兴趣的领域是有机化合物的使用。目前的努力在于使它们的制作方案标准化，但也有必要使它们血管化，原因如前所述。
芯片上的器官在药物发现领域引起了人们的极大兴趣，在过去的几十年里，许多学术团体开创了这一领域的先河。缓慢但肯定的是，许多不同器官的原型正在出现，这项技术现在正朝着同时集成几个相互关联的器官的芯片方向发展，以模仿更系统、更完整的模型。这些模型可能成为测试药物和构成细胞植入物的生物材料的细胞毒性的替代品。
所有这些发展都是在更普遍的个性化医学范式转变下出现的。个性化医学倾向于开发针对患者自己的细胞定制的治疗和诊断工具。换句话说，现在人们认为，在不久的将来，可以从每个患者身上提取细胞，并将其整合到本综述中描述的任何一种3D细胞培养试验中，以便在体外重建患者自己的组织。
最后，我们预计免疫活性模型将成为3D细胞培养领域的关键发展。现在越来越清楚的是，免疫细胞在许多疾病中发挥着关键作用，实际上可以直接作为帮助患者的手段。癌症免疫疗法的成功证明了这一点，这种疗法可以重新教育免疫细胞，使其更好地识别和抗击癌症。因此，将免疫细胞包括在3D体外细胞模型中将变得至关重要，以更好地了解它们的作用并筛选可以针对它们的药物。有趣的是，一项研究表明，许多在老鼠身上有效的药物在人类身上产生了不可预见的副作用，因为它们具有免疫抑制作用。因为它们削弱了免疫系统，机会性病原体成为患者感染的原因。因此，临床前模型应该包括免疫细胞来预测患者免疫抑制的风险。免疫系统也是生物材料植入后经常引发的炎症的罪魁祸首。将免疫细胞纳入体外模型将有助于更好地预测生物材料引起有害反应的可能性。
有趣的是，这项研究揭示了免疫抑制药物往往与人类的毒副作用有关，这不仅揭示了免疫细胞，也揭示了病原体。换句话说，虽然这些药物也会抑制老鼠的免疫系统，但老鼠身上的病原体与人类的不同。对于那些根据自己的情况或治疗而可能拥有独特微生物群的患者来说，情况尤其如此。因此，一个理想的药物测试体外模型也可以包含人类病原体，以预测与药物治疗相关的感染。
对于所有这些3D细胞培养的发展，最大的挑战将在于检测验证。事实上，人们需要验证体外数据的相关性和有效性，并将它们与体内结果进行比较。首先，这意味着我们需要为广泛的疾病识别相关的生物标记物，我们可以在体外模型和人类临床数据之间进行比较。其次，需要努力寻找可以与体外模型进行比较的人类临床数据。虽然如此多的挑战很可能会通过无数的社会和技术改进来解决，但我们认为微流控芯片可能是解决我们提出的几个问题的一个有前途的途径。

10. 微流控可以做些什么？

首先，微流控技术在自动化和加速繁琐的桌面程序方面已经显示出巨大的潜力。例如，一些微流控芯片具有自动化的ELISA协议，并且在将质谱学结合到微流控芯片上进行了大量的工作。这将成本和时间降至最低，但也通过最大限度地减少人为干预来帮助标准化结果。然而，向3D细胞的操作迈进可能会被证明是更困难的。虽然在微流控工具中操纵流体是常规操作，但操纵和混合不同粘度的溶液(如细胞悬浮液和3D水凝胶)更具挑战性，因为它需要一套设备来克服层流流动。
研究小组还找到了将微流控芯片与简单读数相结合的方法。例如，怀特赛德小组已经开发了基于纸张的比色微流控技术，这样只需通过颜色变化就能显示出检测结果。微流控芯片在促进个性化药物方面也具有明显的优势，因为它们需要少量的细胞，因此这些细胞可能都来自患者。
与此同时，已经在努力开发具有受控环境的微流控芯片，就像生物反应器一样。例如，重新创造低氧环境的微流控工具已经被创造出来，以模拟癌症组织中的低氧。在另一项研究中，微流控芯片被连接到压力控制器，以对细胞施加周期性压力和压力，就像它们在肺中所经历的那样。换句话说，微流控芯片可以成为自己的微型生物反应器，从而获得我们已经讨论过的生物反应器为3D细胞培养提供的许多好处。与此同时，具有集成传感器的微流控技术正在开发中，并且很可能在不久的将来变得更加普遍。传感器的存在，就像在生物反应器中一样，能够监测重要的变量，并促进自动化和可追踪性。
微流体实现的自动化、小型化和精确化也将有助于标准化细胞分化等敏感程序。事实上，需要分化的细胞，如干细胞或单核细胞，通常使用常规的宏观体外实验程序进行分化，如果不控制化学和环境刺激，这种方法可能容易出现很大的变异。相比之下，微流控芯片可以精确控制培养液中营养物质的输送，或氧气浓度或流体性质，所有这些都已被证明影响干细胞分化。同时，将这些芯片与蛋白质分析等传感器相结合，可以解开特定信号和信号通路在细胞分化过程中的作用。

微流控技术促进的小型化和自动化最终提供了将繁琐的程序从科学中心分散到更偏远地区的可能性。这已经被用于检测肝功能的微流体。相比之下，微流控应用于3D细胞培养目前需要许多步骤，而这些步骤只能在实验室中进行。然而，随着正在进行的发展，3D细胞培养微流控也可能成为直接用于临床的临床点诊断方法，即使不是在偏远地区。
独一无二的是，微流控芯片能够对血管结构进行灌流。简而言之，当内皮细胞混合在适当的3D凝胶(如纤维蛋白)中时，它们就会形成血管。虽然这可以以任何形式发生，但微流控芯片中的血管形成直接连接到微流控通道的开口。这意味着人们可以通过微流体通道直接接触到血管的血管内隔间，从而使血管可以被颗粒、细胞或介质灌流。这对于重建许多涉及细胞或分子在血管系统内运输的生物过程，或者仅仅是能够在血管系统内灌流药物，就像它们将在患者体内输送一样，是至关重要的。另一方面，有机类化合物也可以在微流控芯片中生长，以更好地控制它们的发展。也就是说，微流体室将在一定程度上限制并控制有机物的形状和大小。最终，有机化合物可以与微流控芯片中的血管网络混合，获得可灌流的器官模型，并获得更复杂的组织模型。最终，在微流控芯片中结合干细胞/有机体意味着能够使用患者来源的细胞来创建个性化的细胞模型。
同时，微流控系统特别适合免疫细胞的研究，正如在其他地方广泛回顾的那样。这是因为它们允许建立细胞因子梯度，这是免疫细胞的重要指导信号。微流体模型提供的流量控制对于重建血液循环中的免疫细胞传输至关重要。同样，前面讨论的在微流控芯片上灌流血管的能力也特别有助于重建免疫细胞在血管内和血管间的运输，就像它们在体内所做的那样。最后，免疫细胞是高度流动性和异质性的细胞，这必须经常被视作研究它们的一种手段。微芯片极大地方便了他们进行详细分析的高分辨率成像。
最后，微芯片一直是芯片器官腾飞努力背后的唯一技术。正如我们之前所讨论的，微芯片提供的对微环境的更多控制使得这项技术成为开发有机模式的独特技术。此外，流动的促进使所述器官之间能够连接和相互作用，以及分子从一个器官到另一个器官的运输。这些相互作用已被证明是药物测试的关键。例如，肠道和肝脏被结合在芯片上，因为药物首先通过肠道吸收，然后由肝脏代谢。它们的结合已经被证明对药物命运的影响不同于单独培养肠道肝脏的芯片。在芯片上添加胃可能对模拟胃排空也很重要，所有这些都会影响药物的药代动力学。最终，人们可以想象一种芯片上的身体产品，其中基本的器官型组织通过可灌流的血管系统相互连接，以测试人体对药物的全身反应。
最近，研究人员首次在芯片上以3D生物打印心脏：这显示出促进和标准化芯片上器官制造的巨大希望。此外，软应变传感器被集成到组织的微体系结构中，为芯片上的仪器器官铺平了道路。
总而言之，我们相信，如果有真正的努力将其潜力从学术环境转化为临床世界，微流控技术将为3D细胞培养领域提供很大的帮助。最有可能的是，解决方案不仅将借鉴微流控技术，还将借鉴水凝胶和生物反应器技术的进步，最终融入一个协同领域。然而，所有这些都需要工程师、生物学家、临床医生、卫生监管机构…之间的共同努力。所以，让我们一起努力吧！

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