动物模型 | CAR-T治疗相关细胞因子释放综合征小鼠模型的建立

人间宝藏

CAR-T细胞疗法临床治疗并发症严重危害患者自身安全，如细胞因子释放综合征（cytokinereleasestorm，CRS）和神经不良反应等并发症，其中，CRS为最常见的严重不良反应。CRS往往发生于患者接受 CAR-T细胞输注数小时或数天后。目前，临床医师通过监测血清中IL-6和C反应蛋白等因子的浓度来判断CRS 发生的可能性以及干预时机，但这种方法需要在短时间内多次验血以检测相关细胞因子浓度水平，一定程度上不仅给患者带来极大痛苦，也增加了治疗成本。

简单的体外细胞模型难以模拟CRS的发生，更难以用于探究CRS不良反应发生的关键机制。有研究显示，单核细胞在CRS发生过程中发挥非常关键的作用。因此，选择合适的动物模型能够模拟临床患者发生CRS的过程，为后续探究影响CRS 发生奠定基础。

动物的选择

Ｔ细胞、Ｂ细胞和ＮK细胞缺失但单核细胞发育正常的重症联合免疫缺陷（SCID/Beige）小鼠适合用于CAR-T细胞治疗相关CRS研究的动物模型。

造模方法

• CAR-T细胞制备：收集健康人群来源的外周血，密度梯度离心法收集外周血单核细胞后，磁珠分选获得CD3＋T细胞，加入CD3和D28免疫磁珠刺激活化CD3＋T细胞。将包装好的病毒颗粒按照感染复数为５感染活化后的CD3＋T细胞。感染３ｄ后应用流式细胞仪检测CAR-T细胞阳性率。
• CAR-T细胞功能检测：将磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS） 组、UTD-D组和CAR-T19组细胞与CD19阳性肿瘤细胞（Nalm-6和Raji）或CD19阴性肿瘤细胞（K562）按不同的效靶比（分别为0:1、1:1、5:1、10:1、20:1）共孵育，流式细胞术双染法检测细胞凋亡情况，ELISA分析各组的细胞因子分泌情况（效靶比为20:1）。
• ELISA试剂盒检测小鼠细胞因子分泌：取小鼠血清，96孔板中加入100μl标准品和检测样品，室温于振荡混匀仪（200rpm）孵育21h，洗板３次后每孔加入100μl 1×检测抗体，继续室温于振荡混匀仪（200rpm）孵育1h，完成孵育后，每孔加入100μl 1×Avidin-HRP振荡混匀仪（200rpm）孵育30min加入3，3′，5，5′⁃四甲基联苯胺室温避光显色10min，加入终止液终止显色反应（颜色由蓝变黄）后立即采用酶标仪检测450nm波长处吸光度（A）值，依据标准品的浓度及A值于Excel中描述标准曲线，根据标准曲线和样品A值计算样品细胞因子浓度。
• 非抗原特异性Ｔ细胞在SCID/Beige小鼠中诱发CRS：６～８周龄雌性 SCID/Beige 小鼠６只，分为２组，每组３只。一组经尾静脉注射人Ｔ细胞（Ｔ细胞组），另外一组经尾静脉注射人Ｔ细胞和Ｔ细胞活化抗体（OKT-3抗体，Ｔ细胞＋OKT-3抗组），检测小鼠的体温、体重和行为活动。注射后0、3、6、12、24 和 36ｈ于小鼠尾静脉取血，ELISA 试剂盒检测小鼠血清细胞因子水平的变化。
• Raji-Luc2 皮下移植瘤模型的建立及分组：6～8周龄雌性SCID/Beige小鼠９只，分为３组，每组３只。第０天分别通过尾静脉注射PBS、1×100000个和5×100000个Raji-Luc2细胞，分别记为PBS组、低负荷组和高负荷组，确认成瘤7d后，经尾静脉注射2×10000000个CAR-T19细胞。
• CAR-T19细胞引发小鼠CRS：注射CAR-T19后，间隔6h测量小鼠体重及体温的变化，同时尾尖采血，收集在肝素钠预处理的离心管中，离心半径8cm，2000r/min离心10min，收集血浆，依据ELISA试剂盒说明书检测小鼠血清中CRS相关细胞因子人IL-2、人γ-干扰素（Interferon-γ，IFN-γ）、鼠IL-6、人IL-15、鼠粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子（ Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）水平的变化。
• Raji-Luc2细胞移植瘤生物发光区域及其强度的测量：采用成像系统对SCID/Beige小鼠进行生物发光成像，运用活体图像软件对Raji-Luc2细胞移植瘤发光区域及强度进行分析，计算绝对光子数。
  
  

结果

• CAR-T细胞构建：含4-1BB共刺激结构域的CD19特异性CAR结构（CAR-T１９）由 CD19抗体的单链可变区、CD8跨膜区、4-1BB胞内区以及CD3胞内区组成。慢病毒载体感染后，人CD3+T细胞中CAR阳性率＞30％。
• CAR-T19细胞特异性识别 CD19分子：分别将PBS组、UTD-T组和CAR-T19组细胞与CD19阳性肿瘤细胞（Nalm-6 和Raji）或 CD19阴性肿瘤细胞（K562）共孵育，结果显示，CAR-T19细胞能够有效靶向 CD19分子并发挥杀伤作用ELISA结果显示，在CD19抗原存在时，CAR-T19细胞与Raji、Nalm-6 共孵育组细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平均高于K562共孵育组。    PBS组T细胞或CAR-T细胞在无CD19抗原存在时，均未显示出杀伤活性和细胞因子分泌。表明CAR-T19能够特异性识别CD19分子，并成功分泌细胞因子IFN-γ和IL-2，从而发挥杀伤作用。
• CAR-T19细胞对Raji肿瘤细胞的杀伤作用：PBS组、低负荷组和高负荷组小鼠成瘤后，第7天经尾静脉回输活化后的CAR-T19细胞。在接种肿瘤细胞的第13天，小鼠成像实验显示，低负荷和高负荷组小鼠肿瘤荧光强度均低于接种肿瘤的第7天，高负荷组肿瘤荧光强度降低约97%，低负荷组肿瘤荧光强度降低约95%。表明 CAR-T19回输后，CAR-T19细胞在体内能够杀伤肿瘤细胞。
• CAR-T19细胞杀伤Raji 肿瘤细胞诱发小鼠体内CRS发生：荷瘤小鼠注射 CAR-T19细胞72h后，血清中T细胞活化相关细胞因子IL-2、IL-15、IFN-γ水平迅速增高，单核细胞相关因子IL-16、GM-CSF分泌增加，同时伴随有体温升高和体重降低等CRS典型特征。小鼠肝、肾、肺组织病理切片HE染色结果显示，低负荷组、高负荷组小鼠肝、肾、肺组织无明显损伤。说明CAR-T19胞自身不会引起小鼠CRS，而在接种了高剂量或低剂量Raji细胞的小鼠中，CAR-T19细胞均引起小鼠CRS。