转录组测序那些事儿

APExBIO

RNA质检

优秀的RNA应该有的样子

1. OD值:

OD260/OD280：1.8-2.4

OD260/OD230：1.5-2.4

2. RNA胶图认证：

要求28S条带要比18S条带亮一倍，且条带不弥散

试剂盒提取一般不会出现5S条带哦~
3. Agilent 2200鉴定RNA 的完整性

RIN（RNA integrity number）：

1≤RIN≤6：明显降解，RIN值越小，降解越严重

6≤RIN≤7：轻微降解，或者样本特殊，需根据峰形图、胶图、样本类型综合考虑

7≤RIN≤10：RNA的完整性较好，可以开展后续实验。

据研究表明，在活细胞中，mRNA降解受到严格的调控，转录本会在不同的机制下以不同的速度降解，mRNA的合成及降解的平衡有利于mRNA的丰度稳定，从而有益于生命体的正常运转。但一旦样本离开活体后，RNA的降解就不属于正常细胞的生理过程了，目前还不确定死亡组织中RNA的降解是否具有一致性。

不合格的RNA千奇百怪

1. OD值:

OD260/OD280：低于1.8表示可能有蛋白质污染

OD260/OD230：低于1.5表示可能有明显的有机物残留

2. RNA胶图认证：

28S已没有清晰条带，且条带弥散

无条带显示

可能存在支原体污染
3. Agilent 2200鉴定RNA 的完整性

样品降解，出现多余的峰型，RIN＜6

支原体污染，出现23S和16S的峰型
4. RNA降解的可能原因：

新鲜细胞：

1. 细胞状态不佳，死亡的细胞可能释放RNA酶

2. 裂解液的量不足，裂解不充分

新鲜组织：

1. 样本采集时不够迅速，样本收集后并未液氮速冻，而是直接放入-80℃冰箱

2. 取材器械与试剂并未进行去RNA酶的操作（DEPC处理）

3. 在送样过程中干冰不足，导至部分样本暴露在常温下

4. 样本经过特殊处理时，处理方式不规范，比如灌注

冷冻样本：

1. 样本存储太久，超过3个月

2. 冷冻过程中经过反复冻融

3. 存储温度高于-80℃

5. 对于RNA质检不合格的样本的解决方法：

1. 风险建库

风险建库的“风险”是什么？

Ø RNA含量低，风险在于可能建库失败

Ø RNA降解，风险在于有效数据留存率低，数据分析时duplication高；对于参考基因组的mapping率低；基因的覆盖率不高等

2. 做其他项目

根据2200峰型和胶图判断是否可以尝试miRNA、circRNA的项目

3. 重新送样

可能存在支原体污染的细胞和降解的样本需要重新送样哦，如果怀疑是支原体污染的细胞一定要进行支原体检测，因为支原体会影响细胞的基因表达；降解样本的基因表达量也会存在一定程度的不一样。重新送样一定要沟通好取样细节哦。

有研究员提出对于降解的样本可以采用去除核糖体RNA的方式代替poly A富集的方式进行建库，这样可以减轻降解样本带来的影响。

为了验证样本降解对于基因表达量的影响，研究者通过将细胞悬浮于PBS中室温（25℃）放置来模拟RNA降解，室温放置0 h、24 h、48 h和72 h后测得的平均RIN值分别为9.8、6.7、4.4、2。以去除核糖体RNA的建库方式进行文库构建，随后测序。


根据数据分析可以看出，mapping率和生物降解程度关系不大，除非是降解特别严重的样本，外显子区域随着降解程度增加，mapping率逐渐减少。


如果样本只是轻微降解的话，这些基因表达差异在可接受的范围内，RIN值的下降导至差异表达基因的数量逐渐增加，包括mRNA和lncRNA，这种变化是RNA降解扭曲了差异表达分析的结果。

测序结果

为什么我用qPCR做出来的结果要比你们转录组测序差异更加明显？又为什么细胞基因过表达/敲低后做转录组测序结果显示基因表达非上升/降低，且与qPCR结果不一致？

1.  低表达量的基因

低表达基因在高通量测序中不容易被检测到，很容易造成测序的误差。但qPCR可对基因进行多轮扩增，因此扩大了低丰度的表达显示。

2.  技术手段不一样

qPCR针对的是单个基因，转录组测序针对的是全部的编码基因，他们的检测出现一定程度（30-40%）不一致时时正常且合理的。

3.  项目为过表达或者敲低的样本

过表达或敲低序列仅为某个基因的一部分（比如某个外显子区域），此情况下qPCR验证时扩增片段仅为某片段，而转录组测序分析为整个转录本分析，因此即使某个区域的过表达或敲低状态并不会影响整个转录本的差异表达。

为什么我的细胞用同种实验处理方式，两次测序显示基因表达量有差别呢？

批次效应是最大的锅！！！

批次效应可因不同时间、不同操作者、不同试剂、不同仪器、不同生物个体的状态等导至实验误差，这些影响因素与研究中的科学变量无关。批次效应对于WB、qPCR影响较小，但对高通量测序的影响较为显著，不建议老师们一个项目分开准备样本，建库和测序哦，批次效应虽然可以用技术手段进行缩小，但是是很难去除的哦。

参考文献

1. Impact of RNA degradation on next-generation sequencing transcriptome data

2. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification

3. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy,reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control consortium.