ELISA试验中设置阴性、阳性、空白对照的作用

青草

一．ELISA试验有效性与三项对照
什么是“有效性”（Validity）？要获得准确的检测结果“有效性”评价，就会关系到：为什么要设置“阴性、阳性和空白”等不可缺少的三项对照？要用什么样的物质担当“阴性、阳性和空白对照（品）”？这“三项对照”如何设置、需要设置几个孔位？获得的测定值如何“认可、取舍与计算”？随后，又如何依照阳性对照均值（PCx）与阴性对照均值（NCx）的差值（P-N，或N-P）大小做出“试验结果有效性”的最终裁决呢？…等等，这一连串的问题，在国外“正规”品牌的ELISA试剂《使用说明书》中都有明细和详尽的说明。既有理论要点提示，又有具体细致的举例解说。很可惜，在90年前后，国内兴起ELISA检测热潮之际，在一片“国外试剂说明书太详细、太复杂、不容易看明白、…”等等“一片埋冤”声中，正好迎合国内商家的“意愿”。从此以后，国产ELISA试剂的说明书，越来越简单。这其中商家就有两个“好处”：好处之一，用A4、或B5，甚至比B5还要小的一张纸，代替国际试剂的好几页的“使用说明书”（等同于一份“操作手册”），每年就可节省一大笔印刷成本费；好处之二，如同国际试剂说明书上向用户交待的各种表明本试剂质量有关的详尽内容，国产试剂的所谓“说明书”上统统可以“删除、回避、拒绝”向用户通报和承诺。我90年前后收集的<美>雅培、<法>巴斯德、<荷>阿克苏等相关试剂的原文说明书，几经搬动全都处理，很是可惜。近日，杭州检疫局朋友送了一份生物梅里埃中国有限公司的中文版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书》。对照阅读之下，深深感到这才是一份真正意义上的《使用说明书》呀！在我下文提到的若干“概念、问题”，从中都可以找到答案。我现在参照我本人1993年的《肝炎ELISA试剂质量与检测结果有效性评价》会议讲稿相关内容，就“三项对照与检测结果有效性”表示如下认识和讨论。

二．三项对照要求与用途
ELISA检测，按照试剂说明书要求，每次试验、每块扳上都要设置以下3项对照和用途：  
1．空白对照：仅用稀释液代替检测样本、用以观测最终反应的显色“本底”、并用于酶标仪消除、扣除“本底”，即：以本底为“零”读取阳性、阴性对照孔和样本检测孔的吸光值（A）；或者，在计算阴性对照均值（NCx）、阳性对照均值（PCx）、样本读数的S/C.O.值时减去空白对照的本底吸光值。早年的酶标仪无自动扣除空白对照孔读数功能，这种酶标议现已淘汰不用了，写上这段话的意思是补充说明设置空白对照的用途。空白孔具体如何读取读数，则依照说明书操作。例如，生物梅里埃中国有限公司的中文版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书》上提示：以空气读空白（不放板架和板条），在450nm（单波长）、或450nm和620—700mn（底物是TMB）参考波长进行读数。
2．阴性对照（品）：
（1）阴性对照（品）的概念与要求：所谓阴性对照（品），应当是本项检测试验中采用与待捡物（样品、人用试剂就是人的血清等）具有同源性和同质性，又不含有待检物质，并能客观比较和鉴别处理因素（血清免疫学试验中有特异性抗原与抗体反应）之间的差异。因此，用动物血清或其制品（如牛血清白蛋白等）代替阴性人血清作为对照品，从理论和实践上都是不可取的，弊端甚多，无须细述。注意：据我所知，国产ELISA试剂中，有的厂牌是用动物血清制品稀释配置、或与部分人血清混合配置的；其二，阴性对照读数，并非是“越低越好”。NCx值接近0.00X水平，这是假象！试想一下，真正采用“阴性人血清”的阴性对照品，NCx值会如此之低吗？举个例子，雅培乙肝六项EIA试剂的NCx值，分别为：0.010（HBsAg）、0.027（抗—HBs）、0.035（HBeAg）、1.083（抗—HBe）、1.065（抗—HBc）、0.045（抗HBc-IgM）。生物梅里埃的HIV试剂NCx是0.091。辨别试剂NCx值是否合理的一个很简单的方法，只要对比大量阴性样本的实际读数就“一目了然”啦！
一个题外插曲：表明ELISA试剂内在质量的一个重要统计标志，就是要看：阴性样本的的上限不应当大于、必须小于C.O.I.=1.00；反之，阳性样本的的下限不可小于、应当大于C.O.I.=1.00！早年我用SPSS软件输出阿克苏HIV和国产甲、乙试剂检测600例左右的健康人体检血清的三幅直方图，可以表明阴性样本的不同分布特征，颇有意思。   
我为什么要如此细说NCx呢？因为NCx值在Cut off值计算中是相当举足轻重的（详后）。  

（2）阴性对照（品）分为两类
一是代表受检人血清中并不含有、或方法学灵敏度未能检出的待检物的基准水平，并且是结果判断值（Cut off）计算式中决定“是”（阳性）、或“否”（阴性）的唯一可变值。阴性对照值高，导致假阴性；反之，导致假阳性。如：HBsAg、HBeAg、抗—HBc等。二是阴性对照设置，在方法学上要求加入指示性定量标准品，如中和剂HBeAg，定量HBcAg等，用以检测抗—HBe、抗—HBc。或者，选取代表平均水平的正常人血清用作阴性对照，如检测抗—HBc IgM。此类Cut off 值计算时，多数均包括阴性和阳性对照值2个可变值。

               
3．阳性对照（品）：
（1）阳性对照（品）的概念与要求：同阴性对照（品），只是采用“精选”的含有待检物质的人血清制备而成。所谓“精选”，就是把收集的阳性人血清经过数种试验进行“筛试”、把含有“干扰性物质”的血清剔除、不用，以避免出现“假阳性”干扰试验结果。  
（2）阳性对照（品）设置，也可区分为两种类型与用途：
一是阳性对照主要用于评价该项试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性。而所设的阳性对照的测量值不列入Cut off值计算、但是不可不做。如HBsAg、抗—HBs、HBeAg等。
二是阳性对照的设置，不仅用于评价试验结果是否有效和试验结果的稳定性与可比性，而且计入Cut off的计算。此时的Cut off值的含义是代表该标志物在健康（正常）人群中正常值范围的上限。待检样本检测值超过该上限（Cut off）时表示有诊断意义。例如抗—HBe、抗—HBc、抗—HBc IgM等。

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三．阴性与阳性对照平均值计算与判断   
1．阴性对照平均值NCx有效性计算判断举例：   
（1）第一类NCx计算与评价：以HBsAg为例
Ⅰ. 设置3孔的NCx计算：NCx=（0.011+0.010+0.090）/3=0.010  
Ⅱ. 任一个NC值应≤0.100至≥－0.010；
Ⅲ. 各NC值也应介于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之间。此时各孔的NC值均处于NCx±0.006范围内，其中遇有一孔NC值偏离该范围时，则弃去该NC值，再计算NCx。如有2孔NC值超出该范围时，本次试验（无效）应予复试。   
Ⅳ. 不同厂牌对NCx的具体要求略有不同，但总的原则几为一致，如<法>巴斯德HBsAg EIA Kit。
（2）第二类NCx计算与评价：可包括抗—HBc、抗—HBe。以抗—HBc、抗—HBe为例：
Ⅰ. 取3孔阴性对照A值的平均值：
抗—HBc NCx=（1.027+0.989+1.278）/3=1.065  
抗—HBe NCx=（1.169+1.088+0.993）/3=1.083；   
请各位注意：这2个NCx是不是很接近1.00呀？也就是说，十分接近C.O.I.（C.O./S，或C.O./A）=1.00！这不是一种偶然，而是国际试剂（如雅培）的“质量”标志。如果偏大，例如1.50以上，或者偏小，0.50以下，待检样本中会导致出现什么现象呢？请读者自己思考吧。
Ⅱ. 各孔NC值均应＜2.000，并处于≥0.5×NCx至≤1.5×NCx之间。若其中1孔NC值偏离该范围时，弃去，再计算2孔的NC值的NCx。如有2孔NC值偏离该范围时，应重新试验。

2．阳性对照平均值PCx有效性计算与评价也分为两类：   
（1）第一类 PCx计算与评价：以HBsAg为例 DauI*sZmR  
Ⅰ. 第一类PCx的计算不列入Cut off计算，可取（设）2—3孔阳性对照的平均值PCx（Abbott）： PCx=（1.024+1.030）/2=1.027。注意：本例雅培试剂HBsAg的Cutoff值=NCx+0.05=0.06，PCx 的S/C.O.=1.027/0.06=17.12。如果S/C.O.超过20.00以上，提示HBsAg阳性对照含量太高！
Ⅱ. 参照方法学的要求，也可规定PCx应≥1.000（指A值），而且各孔PC值要求≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx  
Ⅲ. PC的设置及PCx的计算，主要用于评价本次试验结果是否有效和各批/次试验结果的稳定性和可比性，并不参与Cut off值的计算。同一个批号试剂及其阳性对照品在规定保存条件和有效期内，各次试验时PCx值也应保持相对稳定水平。换句话说，实验结果有效性评价时，也应观测阳性对照的“统计过程控制”（SPC）处于稳定状态—输出“控制图”。

（2）第二类PCx的计算与评价：也以抗—HBc为例
Ⅰ. 可取（设）2—3孔PC 的A值得平均值PCx： PCx=（0.051+0.038）/2=0.045  
Ⅱ. 参照方法学要求，也可规定各孔PC值应处于≥0.5×PCx 至≤1.5×PCx范围内。  
Ⅲ. PCx值参与Cut off值的计算，例如抗—HBc的Cut off（Abbott）：  
Cut off=0.4（NCx）+0.6（PCx）。
该值（Cut off）可以理解为：指示性定量HBcAg反应值的40%加定量抗—HBc反应值的60%之和，恰为健康人群血中抗—HBc正常值范围的界限。任一待检样本的检出值低于该Cut off值时则判为抗—HBc阳性，大于该Cut off值时则判为抗—HBc阴性。

3．计算NCx、PCx有效性与统计控制应用
读者如果注意到NCx与PCx有效性计算规则，很有点像电视上的“去掉一个最小值、去掉一个最大值”的评分办法，就知道统计学上的异常值“粗略”取舍法，把3个对照值中的1个最小、或最大“异常值”剔除，再重新计算余下的2个对照值的平均值。这样，不但可以比较前、后试验的各次反应板之间的NCx与PCx的波动状态，用这样的NCx、PCx去绘制控制图，也可以减少因为含有异常值的平均值造成的“假失控”机率。况且，无论是单值控制图、或是均值控制图，质控数据中是不应当含有“异常值”数据的。

4．ELISA试验统计控制如何借鉴PCx有效性计算与应用，拟在另文中讨论。
四．计算P-N与N-P差值的意义用途
1．国际品牌的EIA试剂，很注重观测阳性与阴性（P-N）、或阴性与阳性（N-P）对照均值之间的差值，以及P/N（或N/P）比值与C.O.I.指数的比较，并把它视为：在评价试剂质量或判断试验结果有效性时是不可或缺的评价指标。我用雅培的EIA乙肝试剂为例列表如下（见附表4—1）：  
附表4—1 HBsAg（a、b、d法）抗—HBsHBeAg抗—HBe抗—HBc抗—HBc-IgM
CutoffNCx+0.05NCx+0.05NCx+0.060.5(NCx)+0.5(PCx)0.4(NCx)+0.6(PCx) 0.25(PCx)+NCx
P-N或N-P≥0.400≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300≥0.300  
1.027-0.010=1.0171.447-0.027=1.4201.202-0.035=1.1671.083-0.040=1.0431.065-0.0481.0170.846-0.045=0.801
P/N（或N/P）与A/C.O.（或C.O./A）比较
P/N=1.027/0.01=102.7A/C.O.=1.027/0.06=17.121.447/0.027=53.591.447/0.077=18.791.167/0.2533.341.167/0.095=12.28N/P=1.083/0.040=27.08C.O./A=0.562/0.01=14.051.065/0.045=23.670.453/0.045=10.07P/N=0.846/0.045=18.8A/C.O.=0.846/0.257=3.29   

例如：HBsAg的P-N要求≥0.400（A、B、C法），其它各项试剂要求＞0.400或0.300。P-N或N-P意义是：如果小于0.400或0.300，需考虑试验操作有误；如复试后仍小于0.400或0.300，则考虑试剂失效。
同样说法，用P/N或N/P比值与C.O.I.指数的比较，也是提供实验者观测实验结果是否有效、可否成立的参考水平。
—敬请注意，国内有的EIA试剂配套提供的阳性（PC）或阴性（NC）对照物含量过高，达到、甚至超过部临检中心临床高值血清的含量。此时，不能参与上述的N-P、或P-N的标准进行评价。

2．可以反过来提问：国际品牌试剂说明书就如此可靠、可信吗？我的答复是：实际用过国际品牌试剂后，您就会获得如下感受和观点：如此详细的试剂使用说明书，就相当于一份相当完整的质量保证指导书，正如<生物梅里埃中国有限公司的中文版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书》>中所郑重声明的：14 性能特点当按照说明书正确操作、结合适当的检测仪器以及相关附件或者生物梅里埃公司的设备时，生物梅里埃公司保证这个体外诊断试剂正确的实验性能。请大家体会一下，国际品牌试剂竟有如此胆量、敢于公开做出如此的书面承诺，靠的是什么？就是当前的一句名言：靠品牌意识、靠ISO的质量管理和保证。  
至于说明书中提供的计算举例（附表4—2），包括：NCx=0.091，清除异常的质控对照，确定PC1-NCx≥0.600、PC2-NCx≥0.600、PC3-NCx≥0.400，计算界限值（Cut off）等等，其引用的具体数据，不是臆造、不是写着好看的，而是参照正常的实验数据举例演算、可供用户参考对比的。如果您的实验数据与附表4—2中举例的数据相差太大、太离谱，它可以提示您“多加思考、找找原因”。如果有网友也在用生物梅里埃公司的HIV试剂，不妨用您的实验数据对照一下，是不是这个情况，向大家说说。

3．如果再注意说明书上的其它信息，例如说明书中的表2、3、4、5都是很值得细看和推敲的：/*;  （1）HIV—抗体阳性样品诊断敏感性：不仅是3个100%，而且更要注意它的阳性样本的数量是445、200和303份（附表4—3），这可是颇为可观的样本数量哦！如果该公司选用的抗体阳性样本是按照WHO的要求预先已经用蛋白印迹法确认为HIV—1、2、型抗体和抗原阳性血清，那么，附表4—2敏感性的3个100%是很有“高度”指导价值的。  
附表4—3 抗体阳性样品的诊断敏感性  
样本数量敏感性
445份HIV—1抗体阳性标本100%
200份HIV—2抗体阳性标本100%  
303分HIV抗原阳性100%  
（2）再看分析特异性附表4—4提示多达4796例的献血员标本特异性竟然有99.9%！如果是按照WHO的要求，可参考Bull.WHO.70(6)：751-，1992；72（1）：129-，1994，这4796例献血员标本事前经过蛋白印迹法确认是HIV阴性样本的话，那么，附表4—3的3个100%，才是真正的顶级国际水平，实在令人惊喜。再看附表4—5列举人血清中对于ELISA检测会产生“非特异性干扰”的9种物质（成份）检测全部“阴性”的结果，也很有临床参考价值。这2幅附表提供如此重要的敏感性和特异性的数据信息，在国产试剂说明书中是难以查悉的。

五．阳性与阴性灰带
此处所指阳性与阴性灰带率%，既是试剂本身的质量评价指标，也是判断待检样本中是否有需要重复复检的可疑样本范围（Sample Retest Range），及各批/次试验时可疑样本占有率。例如雅培EIA乙肝试剂的阳性与阴性灰带%要求如下：HBsAg定为0.0%，意思是：不应当有阳性或阴性“灰带”样本；其余各项目都是10.0%。这又是一个负责任的对试剂质量标准的公开承诺！
这儿说的“灰带”，就是：待检样本判为“可疑”的S/C.O.=1.00＋/－10%的范围、该样本需要复检。

六．笔者附注：.  
笔者一点感想：我90年开始接触ELISA，当时详细讲解ELISA的书籍并不多。随后的数年中，借助应用过几个品牌进口试剂的机会，从反复阅读原版试剂说明书中逐渐地悟出了有关EIA试剂质量的一些“理解与心得”。这些“理解与心得”，从当时的国产试剂说明书上是难以查询获得的。我写这一段话，意思是希望朋友们，是否找一篇国际上标准的EIA试剂使用说明书细细地读一读，比如生物梅里埃中国有限公司的中文版《人类免疫缺陷病毒抗原抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）使用说明书》，并与国产ELISA试剂说明书对比着看看，我想大家一定会有不同的感受。