动物建模 | 肝纤维化动物模型构建

人间宝藏

慢性肝病是指发生在肝脏的病变过程，主要是指肝细胞的损伤和修复的循环过程，一般是指从肝炎到肝癌的过程，其中间环节为肝纤维化，而肝纤维化的核心机制在于肝星状细胞 （ＨＳＣ）的活化和凋亡，ＨＳＣ的过量活化使得辅助生成胶原细胞和基底外细胞的物质大量形成，从而加速了肝纤维化的进程，使得肝纤维化向着肝硬化等不可逆的方向发展。而非酒精性肝病 （ ＮＡＦＬＤ）是慢性肝病发病的重要影响因素，其中发生炎症性病变的脂肪组织称为“毒脂”对发展至肝炎之后肝纤维化病理过程中肝细胞的损伤和修复大有影响。

目前，制作肝纤维化模型可效仿肝硬化模型的分类方法，但需针对目前肝纤维化病变以非酒精性原因增多为主进行针对性造模。近年来，许多学者主力制作标准的肝纤维化模型，多使用大鼠、小鼠或家兔，但本着动物造模应与人类的病变基本相似、肝纤维化分期过程明显、造模的可重复性和简便性等特点，故多使用大鼠进行肝纤维化造模。

造模

方法

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胆汁淤积致肝纤维化

1.1 胆总管结扎法

胆汁淤积是急慢性肝脏疾病引起肝脏纤维化及肝硬化的主要原因之一。胆总管结扎是复制胆道梗阻性胆汁淤积肝纤维化模型最常用的方法。将 8～10 周小鼠麻醉，开腹后游离胆总管进行双重结扎，并在两处结扎线间离断，以确保胆总管完全阻断，之后手术线缝合，关闭腹腔[6-7]。胆总管结扎后小鼠进食量减少，皮毛散乱无光泽，行动变少且对外界刺激 （如声、光等） 的反应减弱，尿液颜色加深，深红带黄，似浓茶样改变。第15天时，肝脏开始明显改变，肝脏明显肿大，谷丙转氨酶、谷草转氨酶升至正常肝脏水平的 10 倍以上，经 HE 染色及天狼星红染色后，胆总管结扎小鼠肝组织可见明显改变：肝脏汇管区及胆管周围肝细胞肿胀、破裂、空泡变性，炎症细胞浸润表现明显，门静脉周围及窦周纤维化明显[8]。胆总管结扎法复制小鼠肝纤维化模型，操作简单，成模率高，肝脏纤维化明显，指标稳定，短期内纤维化不会自行逆转。实验过程中要严格无菌操作，避免后期感染，必要时可在术中或术后给予少量抗菌药物预防。胆总管结扎要熟练、扎实，以防手术线脱落，胆汁或肠内消化液流入腹腔，造成腹腔炎症引起实验动物死亡。

1.2 免疫诱导法

胆管损伤也可以通过给予免疫诱导剂，引起小鼠自身免疫反应，诱发免疫性胆管损伤、阻塞，引起胆汁淤积。如 2-辛基酸偶联牛血清白蛋白磷酸盐溶液，加入含 H37RA 结核分枝杆菌全弗氏佐剂充分混合后，小鼠腹腔注射给药，8 周后可出现明显改变。

1.3 改良饲料法

通过饲喂改良后的饲料或添加剂，也可以诱导小鼠引起胆汁淤积肝脏损伤模型。5-二乙氧基羰基-1，4-二氢二氢吡啶 （DDC） 和 α-萘异硫氰酸盐（ANIT）。每日给予小鼠含 0.1%DDC饲料，1 周后在胆管上皮细胞中可见血管细胞黏附的表达分子、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子-α 上调。持续8 周导至胆卟啉增多，胆管周围肌成纤维细胞活化，引起胆道纤维化与人类硬化性胆管炎相似。每日给予小鼠 0.025% ANIT，饲喂数天后，就可引起胆汁淤积性损伤，引起胆管上皮细胞损伤，胆管上皮扩张，轻度肝细胞损伤和门静脉周围炎症导至肝纤维化。

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化学性损伤诱导至肝纤维化

化学性肝纤维化是由能造成肝毒性的化学物质所引起的肝细胞损伤和修复交替出现导至肝内结缔组织异常增生的直接结果。造模所使用的常用药物试剂为四氯化碳（ＣＣｌ４）、二甲基亚硝胺（ＤＭＮ）等物质，这类物质具有强烈的肝损害性，能够在不同程度破坏肝脏细胞导至肝内结缔组织异常增生。

2.1 CCl4

四氯化碳（ＣＣｌ４）是一种无色有机溶剂，对任何油脂具有极强的溶解性，尤其是动物油脂，因此，在人体表现为强肝毒性。CCl4法是用于复制肝脏损伤模型的常用方法。CCL4模型复制方法成熟，成功率高达 89.33%，简单易行、经济安全。一般从第 2 周开始，就可出现不同程度肝纤维化程度，平均 4.9%，至第 8 周可达到平均 9.2% 的纤维化，能很好地模拟人类肝纤维化 S0～S4 期的病理特征，且与乙肝病毒感染所致肝纤维化的病理特征相似。该方法现已广泛应用于研究鼠类肝纤维化发生机制、筛选血清标志物以及开发抗纤维化药物等。但该方法由于 CCl4处理后的肝毒性剧烈，死亡率较高。总体来说，该方法在某种程度上基本可以满足实验需求，同时也需要改进来弥补缺点。

2.2 DMN

ＤＭＮ 是一种世界公认的致癌有机化合物中间体成分，具有肝毒性、肾毒性和基因毒性等，其代谢后产物对肝脏细胞损伤较大，且易加速其纤维化速度，若不及时中止肝纤维化的过程，最终则形成肝细胞坏死致肝硬化。DMN 具有肝毒性，能引起肝损伤并可导至肝纤维化，并具有致突变和致癌性。注射 DMN2 周后，就可出现明显的肝纤维化（3.72%），第4 周时，肝纤维化程度为 3.73%。该方法操作简单，模型复制时间短，纤维化程度稳定。但由于 DMN 的毒性，该方法存在小鼠死亡率较高等弊端，同时，由于 DMN的强挥发性，工作人员应注意防护。

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高脂类肝纤维化动物模型

高脂类肝纤维化是指主要由于营养失调性引起的非酒精性脂肪性肝病，患者由于饮食习惯和生活方式的改变而长期摄入过量的含脂肪类物质，从而导至肝脏脂肪过度沉积改变肝脏内肝细胞的构造形成肝纤维化。由于现代人物质生活越来越好，摄入过多的脂肪、糖类等物质的机率逐渐增加，所以，建立高脂类肝纤维化动物模型用于研究人类脂肪性肝病有着极为相通的病变基础。高脂类肝纤维化动物模型的建造一般采用雄性ＳＰＦ级小鼠，体重在２０ｇ左右为宜，也可采用家兔造模。一为配方合成高脂饲料造模：配方常以饲料为基本营养来源所占比例约为８０％，再加 入１０％～１５％油类物质如调和油、1.5％胆固醇 和０．５％胆盐及微量元素等，造模６周后取小鼠血清，检验肝功能、甘油三酯和总胆固醇等指标验证造模结果，若出现肝组织内弥漫性分变脂肪滴分布全肝，可视为造模成功。二为配方元素缺乏高脂饲料造模：一般采用６０％～８０％的高脂胆碱缺乏饲料，先适应性喂养，随后分别在第４周、８周、１６周随机处死５只小鼠验证造模结果，一般于第６周开始出现肝纤维化。此种造模方式简单易行，可重复性强，其动物模型与人体内肝脏的内环境病变及其相似，可有效的进行高脂类肝纤维化肝病的病理机制和用药研究。

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酒精性肝纤维化

酒精性肝病（ＡＬＤ）是指主要是受酒精损害较大使肝脏细胞出现脂肪的堆积、纤维化形成并逐步向肝硬化发展，如若在肝硬化之前不及时逆转，则最终导至肝细胞不可逆死亡，还可发展为肝癌。因此，利用已知的肝病临床症状，在与人体有相似机制的动物身上建模，研究其发病机制和病因，对现代肝病的分型和治疗具有极大的意义。现代实验研究，以急性酒精性肝纤维化动物造模和慢性酒精性肝纤维化动物造模，均多以小鼠造模为主，并且以急性酒精灌胃法造模较优，此种造模方法能在短时间内使肝内细胞出现炎症反应，引起肝血清酶ＡＬＴ和 ＡＳＴ的轻度升高，从而出现肝纤维化的病变，从而，也能有效的把动物模型控制在肝病可逆性强的肝纤维化的阶段。而慢性酒精性肝纤维化小鼠造模因违反了动物天生厌恶酒精的天性，所以成模率低。也有研究表明，ＡＬＤ 动物模型主要只涉及轻度肝损伤（即脂肪变性和轻中度炎症）而人类严重的酒精性肝炎往往发生在肝硬化环境中，甚至更严重者可发展至肝衰竭而导至死亡，因此，在现实中的酒精性肝纤维化动物造模，往往需要运用大鼠在慢性酒精性肝纤维化的基础上，造成急性酒精性肝损伤，从而模拟现实人类复杂的肝病发生环境进行同等条件下模拟造模，但由于其操作程序的复杂性，造模成功率也较低，此方法也难于在实验室环境下应用。

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复合型损伤肝纤维化模型

随着社会生活水平的发展，现代人的生活具有一定的复杂性，从而导至肝病的因素复杂多变，甚至是多种复合性因素共同影响肝病的形成和发展，尤其是肝纤维化是肝病的转归发展的中心环节。因此，建立复合型损伤的肝纤维化动物模型极具临床必要性和符合肝病流行病学发展的需求。建立复合型肝纤维化模型采用乙醇灌胃、高 脂饲料喂养、高糖饮水等复合因素，并结合腹腔 注射 ＣＣｌ４的改良版联合方法造模。采用标 准ＳＤ级大鼠，体重在２００ｇ左右，在适应性喂养１周之后用此方法分组造模８周，在第４周和第８周分组随机抓取５只大鼠取标本进行病理学、肝功能指标检测，第８周后模型组、对照组大鼠均形成肝纤维化。此种造模方法的优点是可以在短时间内建立可重复性高、稳定性强的肝纤维化模型。同时，在一定程度上解决了单一因素的动物模型与现代临床患者病情有差距的问题，复合型肝纤维化动物模型的成模率高，动物在造模期间的病死率较低。

小

结

简单来说，建立动物模型的对研究人类疾病有着很好的帮助，但是，由于动物本身和人体系统还是具有一定的生物学，导至动物模型也不能完全代替人体用来进行更精确的病程研究。近来，有数据表明，人体机体的老化也会影响慢性肝病，特别是对慢性肝病晚期的血液循环和肝纤维化产生影响。然而，我们目前较为成熟和广泛应用的肝纤维化动物模型绝大部分是使用成年的或幼年的小鼠、大鼠或家兔进行基础建模，此种方法下建立的肝纤维化模型是否能有效研究老年化肝纤维化病变的发展仍未可知。随着现代对建模方式的不断改良，有望建立客观、可控性强和可重复性高的肝纤维化动物模型，能更好的研究肝纤维化的发病机制，寻求更好的逆转纤维化进程的药物，从而及时截断肝纤维化向肝硬化甚至慢性肝病的终末病程发展的大趋势。

参考文献：

[1]艾丁丁,罗伟生,蒋云霞.动物肝纤维化模型建立研究进展[J].陕西医学杂志,2020,49(07):907-909.

[2]王梓睿,田飞鸿,饶木艳,姚继红,李华,王丽.小鼠肝纤维化模型复制方法的研究进展[J].中国现代医学杂志,2021,31(12):46-50.