动物造模 | 深静脉血栓动物模型的构建

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静脉血栓（Deep vein thrombosis，DVT）是多种因素引起的静脉血栓性疾病，是目前临床常见疾病并发症之一。该病发病率高，危害性大。静脉血栓成因复杂，主要有遗传因素、创伤、血液粘度增大、长期固定、血管内皮功能异常等。目前血栓的发生发展的具体信号传导通路还不完全明确，研究血栓形成的信号传导通路、标志性的早期预警因子及预防、治疗的药物的研发都离不开动物模型。所以如何高效合理建立静脉血栓动物模型有助于深入探索深静脉血栓形成、发展、转归的病理过程和分子机制，并有助于研究早期预警、治疗方法和药物选择。

目前制备深静脉血栓动物模型的方法很多，主要是依据血流淤积、静脉内皮损伤和血液高凝状态进行制备DVT动物模型。具体选用何种动物及制备方法需根据具体的实验要求和条件选择。

动物的选择

实验动物的选择与实验结果息息相关，一般主要选择与人类基因较为密切的活体动物，但随着对DVT研究的目的、条件不同，对动物的选择也有差异，这些差异还包括人与动物体型大小、寿命、血管大小和规格等差异。DVT研究对模型动物的要求主要体现在四方面：一要考虑DVT发展过程（急性、慢性、亚急性）的不同在动物身上的体现；二要确保动物模型形成的血栓稳定可靠，且与人体静脉血栓形成的病理过程一致；三要保证造模动物成活率高，存活时间长；四要考虑实验动物是否易管理、易饲养、费用高低等问题。选择时应综合评判，目前常用于DVT造模的动物如下：

小鼠

小鼠繁殖能力强且周期快，是生命科学研究中最常用来造模的动物。小鼠常用于DVT的研究，其优势在于易获取、价格低、饲养方便、适应能力强、造模时间短，代谢率高。有研究者认为鼠模型，尤其是涉及肾静脉平面以下的下腔静脉模型，技术操作简单，实验成功率也高，且广泛应用于急性和慢性DVT的研究。但小鼠模型也有其局限性：小鼠体积小，下腔静脉较细，且没有瓣膜，多用血管结扎手法造模，形成的血栓采集困难，且血流动力学、血管大小、凝血及演变过程与人类DVT形成及演变必然存在一定的差异。

其他鼠类

包括大鼠和裸鼠等。大鼠也常用于DVT模型的研究，其较小鼠的适应能力、生存能力及抗感染能力更强，相比于其它中大型动物而言价格低，血栓完全形成的时间快，但大鼠与小鼠存在同样的局限性。裸鼠也可用于DVT造模，裸鼠先天缺乏T细胞免疫，不干预异体组织和细胞，可以使用人类自身的细胞观察血栓溶解、机化的过程，这是其他动物模型所不具备的，但裸鼠生存对环境要求严格，故临床DVT造模时较少选用。

兔

兔子性格温顺，与大鼠对比，兔下腔静脉较粗大，造模操作更容易，且血栓长度长，易于采集，血量更丰富，两者都可形成稳定的血栓，成功率高，也符合人体DVT急性期病理演变的特点，除价格较鼠类贵外无明显差异；相比犬、猪等大型动物，购买成本及饲养成本低，给药方便，利于实验观察。但兔子对感染的耐受力差，且由于生存周期长，老龄兔搜集困难。

其他动物

猪、犬和狒狒这类非人类的灵长类动物也可用于DVT造模，这类大型动物有与人类相似的静脉解剖结构，在血流动力学和血液学参数上具有其他动物不可比拟的优势，且静脉粗、条件好、便于观察，从而补充其他动物模型相关的不足，缺点则在于静脉壁较薄、对操作者技术要求高、管理困难，死亡率高，且饲养条件和经济成本等也较其他动物高，此外，并不是所有的大型实验动物模型都具有与人类的相似性和关联性。

造模方法

下腔静脉结扎法

下腔静脉结扎法原理为：通过手术对实验动物下腔静脉阻塞造成：

（1）局部血管损伤，暴露血管内皮下组织因子；

（2）局部造成低氧环境和炎症反应的发生，静脉内皮细胞变性，细胞浆内大量空泡形成，细胞水肿呈球形等因素；

（3）损伤后炎症细胞浸润及各种细胞因子释放。

操作方法：实验动物麻醉后，沿腹白线切开进入腹腔，将小肠用一块湿纱布包裹保护后推置于动物右侧腹腔，显露下腔静脉及其主要属支，于左肾静脉下方结扎下腔静脉，后还纳肠管并关闭腹腔。

评价：此法在研究溶栓和观察血栓的动态过程中并不适用，且与人体DVT疾病的形成和演变不相符。

下腔静脉狭窄法

通过外力加压下腔静脉致血流减少，导至层状血栓形成，在保证血栓形成稳定性的同时，保持近心端通畅。

操作方法：实验动物麻醉后，取腹部正中切口并将小肠牵至腹外，不结扎周围分支。用外科神经血管钳在15 s内钳夹肾静脉以下的下腔静脉2次，再用1根5-0缝线纵向置于下腔静脉腹面，另1根4-0丝线绕在下腔静脉和缝线周围，之后移除缝线，让血液流过。另外一种改进法是：没有外力加压，但结扎侧分支，保持后侧分支开放，将 1 根 30 号的针头与下腔静脉用 7-0缝线一并绑绕，再移除针头造成血管大约90%的狭窄。

评价：该方法成栓原因为血管缩窄和内皮损伤，且移除针管后血管部分再通，所以，该方法被认为适用于研究深静脉血栓启动机制研究和动态分析溶栓药物机制。

电解下腔静脉法

电解法的原理是直流电作用于血管，刺激内皮细胞产生反应。

操作方法：首先麻醉动物并显露下腔静脉及其属支，结扎下腔静脉周围部分属支。分别用1个针头，连接到1个镀银的铜线并插入皮下组织（阴极）和尾部的下腔静脉（阳极），施加 250 μA 的直流电 15 min，引起内皮细胞产生反应形成血栓锚，并认为造模 2 d 后是急性 DVT，14 d 后是慢性 DVT。

评价：此法建模过程中血管温度稳定，血流影响小，类似于临床上的深静脉血栓形成条件，对局部组织刺激较小，适合研究血栓形成位置局部的细胞因子等变化。

促凝物质干预法

促凝物质干预法就是通过增加局部血液中促凝因子，促进血栓形成。

操作方法有：局部注射促凝剂或糖皮质激素等药物，导至实验动物血液高凝状态而产生 DVT。此法能够减轻手术刺激模拟非手术、创伤等条件下出现深静脉血栓。

实验方法：肌注 3% 戊巴比妥钠麻醉成功后将犬仰卧固定在操作台上，任选一侧股静脉区备皮，消毒、铺单，结扎股静脉的近、远端，并向腔内注入生理盐水5 mL稀释的凝血酶100 U。经彩色超声证实深静脉血栓的形成，并通过超声弹性成像能有效地反映不同时期血栓的弹性硬度，可以根据血栓的弹性硬度来初步判断血栓形成及分期。

评价：该模型可以模拟临床因长期使用糖皮质激素及肿瘤等非外伤手术等因素造成的自发性深静脉血栓。

机械损伤法

血管内皮损伤和血管、肌肉、骨骼等组织联合损伤都容易造成患者出现深静脉血栓。目前研究手术和创伤造成的深静脉血栓多用创伤模拟法进行造模。

01

人工造成静脉内皮的损伤法

通过血管夹在静脉壁外直接钳夹造成对静脉内壁的损伤；或者用刮匙对静脉内壁造成损伤。有学者在阻断下腔静脉后，快速注入生理盐水，造成血管内皮细胞损伤，恢复血流 25 min 后观察到血栓形成；或用蚊式钳在股静脉不同位置分别钳夹3 s，并用髋关节“人”字石膏固定的方法来制备 DVT 动物模型。

评价：该方法常用于研究深静脉血栓和炎症及炎症因子之间的关系。

02

机械击打装置法

通过物理创伤可建立具有骨科临床特点的创伤性肢体DVT动物模型。

操作方法：是用定量打击装置进行击打造成实验动物骨折或损伤组织并固定模拟临床上创伤—固定这一过程。具体方法是用一定能量击打造成的骨折，行髋关节“人”字石膏固定，7 d 后用肉眼和光镜观察DVT形成。

评价：该方法造模成功率差异较大，但较为符合临床实践中创伤引起的深静脉血栓形成原因。目前仍有大量学者使用该法进行抗凝药物机理研究和相关基因及信号传导通路研究。

总结

目前建立深静脉血栓模型，选择实验动物和建模方法众多，各有利弊，在实验设计时应根据具体实验目的和实验室条件进行选择。

造模方法评价：下腔静脉结扎等方法成功率高，对血管影响大，并不能完全模拟临床实践中自然形成的深静脉血栓；促凝药物法可模拟高凝状态形成血栓；机械打击法最符合骨科创伤后血栓形成的临床过程，但是目前造模成功概率不稳定。

迄今为止，建模方式中大多数模型仅能体现血栓形成三大因素中的静脉壁受损、静脉血流滞缓两因素，多无法体观血液高凝状态这一因素，这也是将来深静脉血栓形成动物模型研究中需解决的问题，此外，大部分的造模方法都适宜于研究急性和慢性DVT，而对亚急性的模型研究较少。

因此，深入了解每一种动物模型的优势和缺陷，包括详细的特征描述，对于特定的研究问题选择合适的模型是十分必要的。直到目前为止大多数造模方法还未建立统一的评判标准，相信随着医疗科学技术的发展会让造模更加的简单和科学，对造模过程细节的把握也将更好，我们需要根据不同的研究目的以及不同的发病机制，选用不同的造模方法。