保护剂添加对冻干过程中的重组羧肽酶B活力稳定性的影响

SHYaxin

保护剂添加对冻干过程中的重组羧肽酶B活力稳定性的影响

将可能具有保护作用的集中冻干保护剂添加到重组羧肽酶B酶液中，然后进行冷冻干燥，比较其对酶液冷冻干燥过程中RCPB稳定性的影响在重组羧肽酶B冻干过程中，加入3%的甘露醇对其保护效果最好，酶活保留率超过了100%。这与胰脏提取羧肽酶B酶液的最适冻干保护剂相符。5%海藻糖作为冻干保护剂，重组羧肽酶B酶活保留率也达到了100%。1%和3%的海藻糖和甘露醇条件下的酶活保留率虽然都在100%以下，但都高于对照组（未加保护剂）的83.8%。这说明海藻糖，甘露醇对重组羧肽酶B都有不同程度的保护作用。保护能力最差的是山梨醇，添加低浓度山梨醇的重组羧肽酶B冻干品，其酶活保留率低于对照组，浓度达到5%后酶活保留率才提高到94.6%。

海藻糖，山梨醇对重组羧肽酶B冻干过程的保护作用具有浓度依赖性，随着浓度的升高，酶活保留率也在上升；而甘露醇浓度达到5%后，酶活保留率反而下降，因此其最适浓度为3%。

保护剂对冻干品的性状及其溶解性的影响

不加入任何保护剂的冻干品，呈白色粉末状，色泽比较均一，但溶解性差，甚至不能完全溶解，可能是因为在冷冻干燥过程中产生的一些应力使得重组羧肽酶B蛋白变性，破坏了蛋白的稳定性。甘露醇是目前最常用的生物蛋白冻干制剂的保护剂，不仅在冻干过程中起到赋型剂的作用，同时也是蛋白的保护剂。加入甘露醇的重组羧肽酶B冻干品外观细腻，色泽洁白，溶解度和澄清度均很好。放置一段时间后，其外观，色泽，溶解度和澄清度都依然很好，没有什么改变。加入海藻糖的重组羧肽酶B冻干品，在冻干刚结束时，其外观，色泽，溶解度和澄清度都很好，但海藻糖很容易吸潮，放置一段时间后，出现萎缩，色泽稍变黄，溶解度和澄清度也变差。而加入山梨醇的重组羧肽酶B冻干品，外观上出现崩溃，结构比较紧密。因此，总的来看，3%甘露醇作为重组羧肽酶B的冻干保护剂，无论从活性的保持以及所得冻干品的外观和溶解性来看，都是最合适的。

讨论

保护剂对液体蛋白质的保护机理，目前被广为接受的是优先作用假说，在有起稳定作用的保护剂存在的条件下，蛋白质优先与水作用（优先水合），而保护剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。在这种情况下，蛋白质表面就比其外部溶液含有较多的水分子和较少的保护剂分子，从而起到稳定蛋白质的水化膜，发挥对蛋白质的保护作用。这可解释本实验中甘油对重组羧肽酶B酶液的保护作用。

冷冻干燥过程中，由于脱水过程本身会使蛋白质损伤，使得复水后的蛋白质很容易失去活性。因此，必须加入保护剂以减少酶活力的损失。目前，对于保护剂稳定生物分子的机理主要有两种假说：一种是“水替代”假说，认为蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后，保护剂的羟基能替代蛋白质表面的水的羟基，使蛋白质表面形成一层假定的水化膜，从而保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中，稳定蛋白质的高级结构。另一种称为“玻璃态”假说，认为在含保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且保护剂的结晶不会发生时，保护剂-水混合物就会玻璃化。在玻璃态下，具有黏性的保护剂包围在蛋白质分子的周围，形成一种玻璃体，阻止蛋白质的伸展和沉淀，维持蛋白质分子三维结构的稳定，从而起到保护作用。有研究报道保持玻璃态的甘露醇在药品冷冻干燥过程中能够保护蛋白质的活性，而结晶的甘露醇则对蛋白质不能起到保护作用