细胞培养如何应对支原体污染

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一．支原体的介绍

支原体是目前已知一类能在无生命培养基上生长繁殖的最小的原核细胞微生物，分为两个属：一为支原体属（Mycoplasma），有几十个种；另一为脲原体属（Ureaplasma），仅有一种。革兰染色为阴性，但不易着色，一般用Giemsa染色，染成淡紫色。支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。

二．细胞受支原体污染严重

（1）据统计世界范围内大约有15%-35%的细胞培养物遭受了支原体污染。

（2）从2013年开始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及细胞培养都要进行支原体检测。

（3）欧洲药典规定对细胞治疗产品需要进行严格的支原体检测。

（4）美国FDA规定为了提高细胞生物制品安全性，需要进行支原体污染检测。

（5）中华人民共和国药典规定主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞以及临床治疗用细胞应进行支原体检测。

三．支原体的污染来源

（1）细胞之间交叉污染；

（2）细胞培养操作人员的口腔、皮肤等；

（3）工作环境或实验器材的污染；

（4）培养基的污染。

四．支原体污染的严重性

（1）细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊；

（2）使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长；导至染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

（3）影响细胞的代谢和功能：培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

（4）培养过程中细胞破碎较多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基；

（5）细胞被支原体污染后会形成共生体系导至污染不断扩大。

五．支原体的检测方法

支原体的污染需要特殊的检查方法，常用的有 DNA 荧光染色法、支原体培养、ELISA、电镜和聚合酶链式反应（PCR）等，由于支原体种类众多，检测有失败的风险，通常推荐采用两种以上的检测方法。

（1）DNA染色法：用荧光染料Hoechst33258，此染料能与DNA特异地结合，可使支原体内的DNA着色，荧光显微镜下支原体呈绿色小点，散在于细胞周围或附于细胞表面。

Vero细胞DAPI染色荧光照片(400×)。A，感染支原体的Vero细胞。蓝色卵圆形荧光物质为Vero细胞核，其周围蓝色荧光小点为支原体(箭头)；B，未感染支原体的阴性对照Vero细胞；C，加入待检培养液的Vero细胞(未感染支原体)。

（2）培养法：将细胞悬液5mL加入45mL支原体肉汤培养基，培养14天后观察肉汤培养有无雾状沉淀，然后取0.5ml加入已冷却到50℃的培养基中，再用琼脂培养基做分离培养，37℃培养3天观察有无“荷包蛋”菌落出现。

（3）ELISA：有专为支原体检测开发的酶联免疫分析试剂盒，通过样品显色反应与标准品对比得出结果。

（4）电镜：一般在细胞培养48～72小时，细胞接近汇合前，用胰酶消化细胞制成细胞悬液后进行固定、包埋、切片后才能进行观察。

支原体电镜扫描图片

（5）PCR：PCR检测法灵敏度高，特异性强，只用一天时间即可快速检测细胞培养液中的支原体，是一种检测支原体的有效手段。引物来自支原体的保守16S-23S的rRNA序列，由于这段spacer的序列随支原体种类不同而不同，因此可依所复制的DNA大小及其特异性片段的大小来作检测及鉴定，目前也有专门的试剂盒，如PCR Mycoplasma Test Kit（Applichem）。

PCR法支原体检测电泳图。+：阳性对照；-：阴性对照；1：送检样品1（感染支原体）；2：送检样品2（未感染支原体）；3：样品1的干扰实验；4：样品2的干扰实验。若在270bp处有条带，检测结果为阳性。阳性对照及干扰实验PCR产物在270bp处有一条带，阴性对照无条带，证明本次实验准确可靠。

（6）以上的几种方法花费时间都还是比较长的，先达基因用自己的专利技术ERA恒温核酸扩增方法，研制出了更为简单，快捷，准确的支原体检测试剂盒，灵敏度比普通PCR高百倍，可以在恒定的低温条件下进行，而且在30分钟以内就可以得出结果，并且检测范围涵盖130种支原体，是一种比较理想的支原体检测方法。此试剂盒借助荧光定量检测仪显示结果，先达基因也推出了自己的荧光定量检测仪，由于ERA方法为恒温扩增，所以该仪器相对比较便宜而且小巧。

方法	灵敏度	准确性	检测范围	时间	费用	工作量
培养法	低	假阴性高	有的种无法进行培养	28天	高	大
DNA荧光染色法	低	假阳性高	广谱	1天	高	大
RT-PCR	高	高	由引物决定	2-4小时	高	较小
LAMP	高	假阳性高	由引物决定	2小时内	较低	较小
ATP酶法	较低	假阴性较高	广谱180种	30min	高	小
ERA	高	高	广谱130种	30min	低	小

六．避免支原体污染的方法

细胞培养中要从多方面避免支原体的污染：

（1）控制环境污染：可以使用支原体清除喷雾进行空间消毒；用新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室或用甲醛熏蒸法消毒无菌室；生物安全柜或超净工作台也要定期消毒；每次使用生物安全柜或超净工作台后要做好清洁工作，减少不必要的物品堆放在内部；在水浴锅和培养箱的水源中加入消毒试剂。

（2）严格操作要求：工作开始要先用75%酒精消毒手部以及袖口、瓶口等；在进行多种细胞培养操作时，所用器具（如移液枪等）要严格区分；在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细菌带到培养液中污染其他细胞。细胞培养实验室应制定严格的管理制度，按照规范的实验程序操作。

（3）保证细胞培养基和器材无菌，器材一般都经过辐射处理，基本可以保证无菌，商业化CD培养基一般也能保证无菌。如实验室有发现支原体感染，已经开启的培养基不宜继续使用。

（4）在培养基中加入适量抗生素：对支原体比较有效的抗生素为四环素类和大环内酯类，如卡那霉素50μg/ml，一些氟喹诺酮也有抑制支原体生长的作用。也有专用的支原体清除剂可用来预防细胞被支原体污染，如在培养基中添加Plasmocin™ prophylactic，工作浓度5μg/ml。

（5）制备细胞的原始组织或器官污染：从来源可靠的原始组织或器官制备细胞。

（6）种子库污染：从可靠来源引进、使用细胞,特别是知名的信誉良好的专门机构,如ATCC、基础医学细胞中心等,这些机构对细胞质量进行一系列检测。细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。建立良好的种子库管理规章制度，并定期对实验室中的培养物进行支原体检测。

七．细胞被支原体污染后的清除策略

（1）对于非重要的细胞，如培养中的细胞、WCB的细胞等，将培养物与用过的培养基灭活后丢弃即可。

对于较为重要的细胞，如来源珍贵或实验室中细胞保藏量较小等可以采用以下（2）-（8）的方法。

（2）用MRA处理：用支原体清除剂处理细胞。

（3）用清洗纯化法清除支原体污染的方法：细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限. 如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。

（4）药物辅助加温处理：先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

（5）使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

（6）动物体内接种除菌法：把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

（7）巨噬细胞吞噬法：从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

（8）使用支原体清除培养基，每2~3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌的平衡盐溶液洗涤细胞1~2次；期间如果细胞密度过大，请保持细胞密度适当（贴壁细胞可能需要用胰酶消化），并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

八、问题

1、应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接灭菌后丢弃之。

3、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

4、支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

总结

在细胞培养过程中，支原体感染发生率超过50%，支原体存在水平较高的研究项目的成果还曾见刊于包括细胞（Cell）、自然（Nature）和美国科学院院报（Proceedings of the National Academy of Sciences）等知名杂志。虽然支原体污染的存在并不能说明这些研究发现是无效得，但这种细菌却可以影响数百个基因的表达水平，并且通过与细胞竞争营养物质而阻碍细胞的生长。因而细胞培养过程中的支原体污染是一个世界性难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。同时支原体可透过一般过滤膜（0.22-0.45μm），对于生物制药领域而言，小试中我们几乎不会使用0.1μm的除病毒过滤膜来过滤培养基（生产中通常都会进行除病毒来保证原液质量），那么小试结果在支原体污染的情况下就显得不那么可靠了，尤其是科研工作者往往不会在第一时间怀疑自己的培养物受到了支原体的污染。对于这种情况，根据笔者的实验室的管理经验，支原体污染的预防更为重要，在新的细胞株入库时，做好支原体等相关检验；规范无菌操作；操作人员在细胞培养与配置培养基时避免不必要的交谈、佩戴口罩、手套与帽子；维持实验室环境卫生；做到以上几点基本可以避免支原体的污染。另外，准备一些支原体检测试剂盒也是很有必要的。

武杰

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