兽医体外诊断的趋势--分子诊断

小书虫

      宠物已成为现代人的重要家庭成员，围绕其吃穿用度、生老病死，形成了一条千亿级的“经济”产业链。其中，需求刚性大、消费支出高的宠物医疗更占据了产业链中的核心地位，成了宠物消费中的“大头”。

宠物医疗服务包括为宠物提供疾病诊疗和日常保健服务，是宠物行业中仅次于宠物食品的第二大细分行业。按疾病种类划分，宠物医疗服务包括宠物外科疾病、内科疾病、皮肤病、传染病诊疗及宠物免疫等。传染病是由某些具有致病性的微生物，如细菌、病毒等引起的，能够在某种动物或多种动物之间传播的一些疾病。养好宠物的关键是疾病的防治，尤其是一些传染病，其发病急、传播快，对动物的健康威胁极大。

在随着人们生活质量的逐渐提升，犬猫在人们生活中扮演角色也日渐重要。并且，随着饲主的观念和宠物医疗质量的逐年提升，在动物疾病的诊断的准确度上，也从以前的「盲人摸象」逐渐走向分子诊断的水平。

目前，分子诊断技术以其具有的灵敏度高、特异性强、简便快速、可进行定性、定量检测等优势，已广泛应用于感染性疾病（包括细菌性感染、病毒性感染、寄生虫、真菌、人畜共患疾病等）、肿瘤等多个领域。分子诊断的检测结果对临床医疗决策的贡献度进一步提升，检验结果的重要性也达到空前的高度。在宠物传染病检测技术方面，分子诊断核酸检测方法同样具有极高的灵敏度和特异性，可最大程度缩短传染病检测的窗口期。该方法也是人类传染病临床确诊的黄金方法。其中以PCR为代表技术的是当前分子诊断最常用的方法。PCR技术是用一对寡聚DNA作为引物，通过变性-退火-延伸这一周期多次循环，使目的DNA得到扩增，具有高灵敏性和高特异性的优势。而实时荧光定量PCR实现了PCR从定性到定量的质的飞跃，实时荧光定量PCR技术（将荧光基团加入到PCR反应体系中，借助荧光信号，累积实时监测整个PCR的进程）不仅具有传统PCR的优势，还具有特异性强、灵敏度高、重复性好、反应速度快、定量准确和自动化程度高等特点，成为国际公认的核酸分子定量的标准方法。实时荧光定量PCR可以早期、精准的诊断宠物疾病在目前的宠物临床工作中，广泛存在着对一部分病原诊断困难或者不能精确诊断的问题。具体表现在以下几个方面：1、现有的诊断技术灵敏度低如：常见用于病毒诊断的胶体金试纸。虽然胶体金试纸可以提供快速诊断，但是该种方法是从蛋白水平对病原进行检测，存在一定的交叉反应和动物自身抗体干扰，导至临床应用的过程中出现假阳性和假阴性的结果；2、疾病的早期诊断（如潜伏期）和抗原要求较高的疾病如：使用传统的诊断技术（胶体金试纸和ELISA检测方法）无法提供准确的诊断依据。如临床上常见犬瘟热和细小病毒；3、临床上有很多的病原没有商品化的便捷的试剂商业化生产这一部分的病原诊断（如猫传染性腹膜炎）目前在兽医临床工作中还不能做到在医院内诊断。如果需要做血涂片、粪检的疾病，导至主观性较强，易产生漏检的现象；4、在疫病防治过程中如注射疫苗是预防犬猫病毒性疾病的主要措施，但是血清学检测出的抗体很难区别是疫苗免疫还是病毒感染产生的，而PCR能够精准的检测病原体；5、临床上还有一些病原在微量时存在诊断困难的情况如小巴贝斯虫等疾病。因此PCR（尤其是实时荧光定量PCR）使这些疾病的精准诊断成为现实。农业部《2013年国家动物疫病监测与流行病学调查计划》的要求，以及我国现行的宠物疾病诊断国家标准中颁布了《犬细小病毒诊断技术（GB/T27533-2011）》和《犬瘟热诊断技术（GB/T27532-2011）》国家技术标准，明确将犬细小病毒和犬瘟热病毒核酸检测（而非试纸卡检测）作为诊断标准，这也说明核酸检测在动物疫病诊断中的重要地位。选择一款合适的PCR产品对于宠物的诊断尤为重要在临床工作中，目前有很多PCR供兽医师们选择，有核酸免提取的、有等温扩增的、有液体试剂和冻干试剂的、有全自动PCR，让兽医师们无从选择，到底应该怎样客观的看待这些，做到科学的选择呢，接下来会详细的阐述。核酸免提取会导至假阴性的概率增加核酸提取是分子诊断实验的“第一步”，是十分重要的环节，因为首先必须把宠物样品中的核酸提取出来，才能进行后续的检测，可见核酸提取的重要性。核酸提取具有两大目的：提纯（消除样本中干扰物质）和浓缩（提高样本中核酸浓度）。因为，对于PCR所检测样品（血清、全血、细胞保存液和粪便等）中有很多干扰物和抑制物，核酸含量低，直接检测核酸难度高，灵敏度差。因此检测之前，需要将样品中的核酸裂解，提纯并浓缩，也就是核酸提取。这是业界的主流做法。比如临床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脱液，成分很简单，几乎是生理盐水+少量分泌物+大量游离的病毒，可以不进行核酸提取直接扩增。猫的疱疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采样就能检出。如果拭子的洗脱液比较干净，可以省去提纯这一步，但是不经过浓缩，降低了检测的灵敏度。此外，复杂样本必须要进行核酸提取。比如猫的冠状病毒（FCoV）大多检测的是猫的腹水，腹水样本非常粘稠，里面蛋白很多，无法直扩检测。这种样本免提取直接扩增就不是灵敏度下降的问题了，而是无法检测出来的问题。等温扩增成本高、较多产品有专利保护的缺点等温扩增仪器简单，检测时间快，检测灵敏度与PCR相仿。但等温扩增技术多为外国发明，现在还都在专利保护期内，应用尚不普及，相对来说成本也较高。真空冻干技术具有诸多优点，是PCR试剂的趋势PCR的试剂成分包括纯化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探针等成分。这些成分混合后，常温下会逐渐降解失效。所以液体PCR试剂需要分装到不同的小瓶-20℃保存，用时再解冻配制。因此，试剂的储运和操作都比较麻烦。而真空冻干技术可将试剂内部的水分完全升华掉，同时不破坏有效成分。冻干之后的试剂可以常温保存，无需冷链运输。使用时加入水就能溶解，然后像正常的PCR试剂使用，因此是PCR试剂的趋势。据了解，苏州的先达基因，拥有完全独立自主知识产权的酶促重组等温扩增技术（ERA技术），通过基因工程对重组酶、外切酶、聚合酶等多酶体系进行改造，建立特殊扩增反应体系，在30-42℃恒温条件下，20分钟内，可将微量DNA/RNA的特异性区段在数分钟内扩增109倍，从而达到可检出水平。该技术具备PCR扩增的特异性和恒温扩增LAMP技术的便捷性，准确度极高。具有可检测性、灵敏性、快速性以及特异性等优点，反应组分已经混合好并冷冻干燥成干粉状态，操作简便，易于保存。且全程自产，相对价格也更有优势。同时配合其荧光恒温扩增仪，可以实现核酸现场检测，不再局限场地、时间或者人员。

分子诊断作为体外诊断技术的第四次革命，应用分子生物学方法，检测患者（宠物）体内遗传物质结构或表达水平的变化，继而作出诊断的技术，它为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供了更为准确的信息。较其他检测方法相比具有不可比拟的优势。而PCR作为分子诊断最常用的检测方法，在宠物的临床诊断中也会越来越重要。同时也相信我们先达基因的恒温扩增核酸检测技术，凭借其检测快速、价格低廉等优势，在及时现场检测市场中会脱颖而出。

boys

新冠检测用--核酸提取用硅胶膜（DNA,RNA,质粒，胶回收）  可用于核酸的提取，病毒检测。1mm厚，A4大小  技术资料：www.abigen.cn   QQ:1492876083

小书虫

苏州先达基因科技有限公司（www.gendx.cn），专注于核酸现场检测，用于独立自主知识产权--酶促恒温扩增技术（ERA技术），在恒定温条件下，7~10分钟即可对痕量靶DNA/RNA特异性区段扩增数亿倍，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平，详情可电联18915569557

黄先生

提供免费试用：可冻干预混液、新型热启动Taq酶、MMLV逆转录酶、Tth酶、直扩试剂、恒温扩增、纯模板快速扩增试剂，磁珠法核酸提取试剂盒。小黄 13189351059