从新冠疫情看分子诊断POCT的发展

小书虫 · 发表于 2020-7-10 16:09

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疾病检测技术一直处于高速发展的过程中，越来越多的手段使人类对疾病的诊断日渐精准。但是，准确率更高的检测手段通常意味着更高的成本、更长的时间、更繁复且条件苛刻的诊断流程，这使得临床往往在面对高度传染性疾病时陷入两难的境地，即大规模确诊病人的紧迫性与捉襟见肘的高端检测资源相冲突。

在此次新冠疫情面前，常见检测手段的局限性就暴露无遗，由于诊断“金标准”分子诊断对试剂、设备、场地、操作人员要求都很高，检测集中在三级以上医院及各大三方检测中心中，资源非常有限，最终在检测能力不足以快速识别所有患者的情况下，为切断传染链只能对所有人采取停工、停学等手段，极大的影响到日常经济活动和生活。

同样的，世界医学最发达的日本、美国等国家地区也无法摆脱检测试剂不足、检测成本高昂等问题。如果能有兼顾高准确率、低成本、操作简易、用时短等特点，适合基层医疗机构使用的检测手段，无疑将大大提高防疫效率。

实际上，分子诊断方法不仅仅在提高准确度、通量等方向进步，也在努力朝着小型化、自动化、高速化、简易化等方向发展，推动分子诊断实现去中心化的目的，普惠基层医疗。在这其中，得益于恒温扩增新技术的使用，已经诞生了一批符合基层条件的分子诊断POCT产品，包括此次疫情中也催生了不少相关产品，值得我们深入探讨和研究。

01、分子诊断的必要性

传染性疾病的诊断方法有培养法、免疫检验、分子检验、质谱检验等，综合效率、成本、准确率、使用难度等各方面因素考量，免疫检测和分子检测是当前最为主要的两种诊断方法。

此次新冠肺炎的诊断也以分子诊断和免疫检测为标准。根据《新冠病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》（“诊疗方案”），新冠肺炎患者有3种确诊方法：“1. 实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2. 病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；3. 血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由隐性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”。

其中前2种方法为分子诊断，第3种为免疫检验。值得注意的是，第3种检测方法是在最新一版诊疗方案中才被加入，分子诊断的权威性则是在一开始就被确立。

免疫诊断虽然有成本低、操作难度低、检测速度快等优势，天然适合普及基层使用，但其对检测有明显的窗口期要求，必须在患者产生抗体后才能有效，这又与传染病确诊的紧迫性相矛盾。

大部分传染病在发病初期的传染性最强，但免疫诊断在此时又难以确诊，容易错失防疫的重要时机。

相比之下，分子诊断虽然成本高、操作要求高，但窗口期要求远远低于免疫检验，在面临重大传染性疾病时，及时性和准确率才是最重要的考虑因素，并没有其他更好的选择。

分子诊断又可被分为核酸扩增技术、基因芯片、基因测序等多类技术，其中以聚合酶链式反应（PCR）为主的核酸扩增技术由于敏感性、特异性表现优秀，操作相对简单且成本低，性价比最高，成为当前最普及的核酸诊断方法。而基因芯片、基因测序则由于技术难度大、设备投入大、试剂成本过高等原因，当前还不具备大规模使用的基础。在此次疫情中，实时荧光PCR技术就成为使用量最大的诊断方法。

02、PCR的局限性有突破空间

虽然实时荧光PCR技术成为此次疫情中最为主要的确诊手段，但其本身具有的局限性也在阻碍着检验产能的提高，造成疫情初始时检验资源严重不足的局面。

首先，PCR操作流程繁琐，导至检验效率低且用时过长。简单而言，PCR需要通过反复升降温，循环“加温-退火-延伸”步骤进行扩增。扩增通常需要1-2个小时的时间，加上前期样本处理、提取的流程，总体操作时间往往要超过3个小时，效率低下。并且，上述繁琐的流程也使得PCR检验对操作人员要求较高，基层并无足够数量的相关人员配备。

其次，PCR对操作场地有严格要求。由于PCR反应过程中不断进行升温、降温，样本液体蒸发后冷凝，容易在空气中形成携带大量样本DNA的气溶胶，进而污染其他样品。因此，PCR检验需要专门的PCR实验室，将试剂配制、标本处理、扩增和分析等操作流程区分开，并通过控制空气流动方向以保证空气清洁度。一个PCR实验室往往需要数百万元的资金投入，这是基层无法负担的，因此我国PCR检测主要集中在三级以上医院和三方大型检测中心中。

从问题出发，要解决核酸检验难以在基层普及的问题，简化操作流程、实现操作的全自动化、设备的全集成化势在必行。可喜的是，恒温扩增新技术的使用，使突破这些局限因素成为可能性。

恒温扩增是一种建立在PCR基础上开发的核酸扩增手段。通过加入特殊设计的酶和引物，恒温扩增无需反复升降温，只需要一个温度即可完成扩增。相比PCR，恒温扩增不仅仅是操作步骤更简单，其对仪器设备的要求很低，反应速度被大大缩短至1小时以内。从20世纪90年代恒温扩增技术被提出后，截止当前全世界共有十多种常见的恒温扩增技术，包括环介导恒温扩增法（LAMP）、转录介导扩增技术(TMA)、酶促重组等温扩增法（ERA）等，其原理也不尽相同。

通过恒温扩增技术的应用，使分子诊断POCT产品成为可能。一方面，扩增的流程被简化。由于技术原理限制，PCR的升降温固有流程难以改变，但是，无需热变的恒温扩增技术只需要一个温度即可完成扩增反应，大大缩短检验时间。另一方面，全自动化、全集成的检验操作正在被逐步实现。通过集成样本处理、核酸提取、扩增、检测所有步骤，再加上全自动化的操作体验，不仅仅使得操作流程更加简易，还能摒除人为因素的干扰，提升结果准确率，好处显而易见。

但是，在生化、免疫等其他各类检测手段都已经实现全自动化的今天，核酸检验还迟迟未能实现全自动化，最主要的原因是核酸检验灵敏度过高，要求各模块密闭，对设备的设计要求很高；同时PCR又需要反复升降温，严苛的温度环境对本就精密性要求极高的设备进一步提出挑战，因此全自动PCR产品开发难度极高。

恒温扩增技术的发展在一定程度上削弱了上述要求的影响。恒温扩增技术不需要升降温环节，各个反应模块实现封闭化，即解决了交叉污染的问题，又使得流程更为简单，同时对反应条件和设备要求也都有所降低。

03、恒温扩增应是核酸POCT检测的新方向

对于疫情的防控，抗体检测更适用于大量疑似病例和无症状感染者的检测，感染者通常在感染1-2周后，才能在抗体检测中呈阳性结果，因此，单独抗体检测不能作为确诊或排除感染的依据。核酸检测较血清抗体检测的优势在于缩短了感染检出窗口期，可及早发现感染者，是目前确诊感染的首选方法，也是“金标准”，通过大范围的核酸检测更能保证疫情的有效控制。

POCT是指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。POCT是检验医学发展的重要领域，具有快速检测、现场采样、操作简便的优点。

通过恒温扩增分子POCT的方式，核酸检测打破了只能在PCR实验室做的局限，将应用场景拓展到出入境、机场、火车站、基层医疗单位等，从而代替一部分免疫检测的市场空间。一方面是各种不需要复杂的热循环设备的等温扩增技术逐步代替PCR技术成为扩增手段；另一方面代替了传统的核酸提取和加样配液等复杂耗时的人工操作，而大大缩短了检测时间，降低了操作门槛。

3月底时，美国媒体报道了雅培公司利用等温扩增技术，研发出了号称目前检测速度最快的新冠病毒核酸检测产品。阳性结果最快可在5分钟内获得，阴性结果可在13分钟内确认，在国际上引起了巨大轰动，甚至连美国总统特朗普和FDA局长都为其“直播带货”，一时间名声雀起，就连普通民众都在谈论。

我国在这一领域虽然起步稍晚，但也已经引起足够的重视，在恒温扩增技术中，酶促重组等温扩增技术（ERA技术），它具有低温适应性，而且在反应速度、灵敏度、准确性等方面有了极大的突破。该技术在低温条件下（25-42℃）可对极微量的病原体的基因片段进行特异性的快速扩增，10-15分钟可将目标基因片段精准复制数十亿倍，只需20 min，就能完成现场检测并出具报告，极大缩短了检测时间。目前也已成功研制出“新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒（RT-ERA荧光检测法）”。

这些企业和产品的成功，预示着核酸检测在我国会随着此次疫情的颠覆性效应迅速扩大市场影响力，而其中能够适应现场检测的POCT产品会获得更好的增长空间。

04、总结

在各项检验技术中，分子诊断有着其他检验手段难以比拟的高敏感性和特异性，更凭借几乎无窗口期限制的优势，成为急性传染病检验的“金标准”。但是分子诊断一直以来是“高大上”的代言词，由于种种技术局限性，造成基层难以普及，也无法在大规模疫情发展下发挥应有的作用。

所幸，得益于恒温扩增等各项新技术的发展并和分子诊断技术融合，普惠化的分子诊断产品逐步成为可能。我们也欣喜的看到，虽然分子诊断POCT行业仍然处于萌芽期当中，但此次抗疫并不缺乏分子诊断POCT产品的身影。

此次面对新冠疫情检测资源严重不足的局面足以为我们敲响警钟，分子诊断POCT产品值得更多的扶持和鼓励，我们未来需要更好的武器去抗击传染病。