时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展

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以同位素标记为主要手段的放射免疫分析（RIA）方法具有灵敏度高，特异性强等优点，在分析检测体内超微量活性物质中获得了巨大发展。随着技术进步，非同位素标记分析技术孕育而生。其中，时间分辨荧光免疫分析(timed-resolvedfluorimmunoassay，TRFIA)技术是非同位素标记分析技术中非常有前途的一种。现从该技术的原理、反应模式、分析系统及应用的研究进展作一综述。

1TFRIA技术原理

TRFIA采用镧系元素及其螯合剂作为示踪物，代替同位素。标记抗原、抗体、多肽、生物活性细胞或核酸探针，待反应体系中的抗原抗体形成免疫复合物，或发生生物亲和素反应、核酸探针杂交反应后，利用时间分辨荧光测定仪测定该体系的荧光强度，从而确定待分析物的含量[1]。

TRFIA技术继承了镧系元素螯合物的固有特点：(1)与普通荧光比较，镧系离子螯合物的荧光衰变时间更长，大约103~106ns，为普通荧光衰变时间的103~106倍；(2)激发光与发射光的Stokes位移大，最高可达278nm，而普通荧光的Stokes位移只有几十纳米。利用镧系稀土离子衰变时间长的特点，在每个激发光脉冲过后，通过时间延缓期，让短寿命的荧光衰变掉后，再打开取样门记录稀土螯合物的荧光强度，几乎可以完全消除背景荧光的干扰，提高灵敏度。

2TRFIA反应模式

TRFIA的反应模式和其他标记免疫分析基本相似。目前应用最广泛的是固相双位点夹心法和竞争法，竞争法又有两种：(1)标记抗原与未标记抗原竞争抗体；(2)固体抗原和游离抗原竞争标记抗体。夹心法一般用于测定蛋白质类大分子化合物，竞争法多用于检测小分子半抗原。无论何种反应类型，最终都要形成结合有镧系离子Eu3+的抗体-抗原免疫复合物。因为稀土离子很难直接与抗原或抗体结合，这就需要在标记待测物质时采用双功能基团结构螯合剂，此螯合剂必须一端与镧系稀土离子结合，另一端则与抗体上的自由氨基连接，形成免疫复合物。由于水的淬灭效应，该免疫复合物在弱碱性缓冲液中经紫外光激发产生的荧光信号相当弱，可以通过加入增强液解决此问题。该增强液能使镧系元素从免疫复合物中解离，并和增强液中非离子型的表面活性剂形成大分子微囊，这种微囊可以最大限度地传递能量，阻断水的淬灭效应。此时，再用紫外光激发就会产生很强的荧光，增强效果可达上百万倍。

3TRFIA分析系统

自20世纪80年代TRFIA问世以来，TRFIA已开发出4种主要的分析系统：解离增强镧系元素荧光分析系统、FIAgen分析系统、酶放大TRFA（time-resolvedflfluorescenceassay）系统、均相TRFA系统。这4种分析系统的主要区别在于使用了不同的螯合物，在液相或固相下实现对荧光的测定。有研究者从技术理论、反应体系等方面进一步改进与完善TRFIA，提出了基于FRET理论的时间分辨猝灭分析技术等。此外，将TRFIA技术与激光等技术联用，扩大了TRFIA的应用领域，现分别介绍如下。

3.1解离增强镧系元素

荧光分析系统解离增强镧系元素荧光分析系统利用聚氨基多羧酸类双功能螯合剂(图1)将镧系元素标记在抗原或抗体上，完成免疫反应后，用酸性增强液解离镧系元素，并与增强液中的另一种螯合剂(如：β-萘酰三氟丙酮)形成高荧光螯合物，再通过仪器测定。此系统灵敏度高，是最经典的检测系统[2]。

3.2FIAgen分析系统

FIAgen分析系统利用一种新型的双功能螯合剂4,7-二（氯磺酰基苯基）-1,10-菲咯啉-2,9-二羧酸(图3)，并将生物素-亲和素系统引入TRFA系统，实现固相测量[2]。

3.3酶放大TRFA系统

酶放大TRFA系统利用碱性磷酸酶水解5-氟水杨酸磷酸酯生成5-氟水杨酸，在碱性条件下5-氟水杨酸可与镧系元素(Tb3+)和乙二胺四乙酸形成强荧光络合物，直接测定荧光[3]。

3.4均相TRFA系统

均相TRFA系统是在时间分辨荧光共振能量转移理论基础上建立的[4]。时间分辨荧光共振能量转移理论是指一对合适的荧光物质可以构成一组能量供体和能量受体对，当两个荧光发色基团足够近时，供体分子吸收一定频率的光子被激发到更高的电子能态，在回到基态前，通过偶极间的相互作用，实现能量向邻近的受体分子转移。利用三联吡啶类穴状化合物(图3)将镧系稀土离子(Eu3+)和别藻蓝蛋白连接，组成了迄今发现的能量转移效率最高的能量供体和受体对，测量前不必分离结合标记物和游离标记物，可以直接测定固相荧光[4-5]。

3.5时间分辨猝灭分析技术

Karvinen等建立了时间分辨猝灭分析技术，此技术基于FRET理论，只是其受体基团是荧光猝灭基团。使用此技术测定了蛋白酶caspases活性：将镧系离子螯合物及荧光猝灭基团分别标记待测caspases相应底物，使镧系离子螯合物及荧光猝灭基团分别结合于底物与caspases作用位点的两侧。当caspases没有作用于底物时，激发光激发后，发生荧光猝灭，没有可供检测的荧光；而当caspases作用于底物时，荧光猝灭基团脱离，激发光激发后，镧系离子螯合物提供了荧光，可以测量。由于此法减少了背景荧光，大大提高了灵敏度，越来越多的应用于检测PCR产物。

3.6分子信标(molecularbencon)技术

分子信标技术是根据核酸碱基配对原则和FRET理论设计的。分子信标为一段与特定核酸互补的寡核苷酸探针，在空间结构上呈茎环结构，其中环序列是与靶核酸互补的探针，茎则由与靶序列无关的互补序列构成，茎的一端连上一个荧光分子，另一端连接一个猝灭分子。当无靶序列存在时，分子信标呈茎环结构，茎部的荧光分子与猝灭分子非常接近(7~10nm)时即可发生FRET，荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，此时检测不到荧光信号；当有靶序列存在时，分子信标的环序列与靶序列特异性结合，形成的双链体比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与猝灭分子分开，此时荧光分子发出的荧光不能被猝灭分子吸收，可检测到荧光[7]。Root等[8]用镧系离子螯合物作为荧光标记分子检测DNA的时间分辨荧光，结果表明此技术的灵敏度比异硫氰酸荧光素染色法高100倍以上。

3.7实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线定量分析未知模板的方法。Gueimonde等[9]利用镧系元素标记探针和双温杂交分析技术进行了实时定量逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），测定了前列腺特异抗原的mRNA，实验中使用了两种探针，探针1与模板的mRNA互补并由荧光报告基团螯合物标记，探针2与探针1碱基互补。在反应中，每合成一条新链就消耗探针1而释放出一个镧系离子螯合物。反应结束后，探针2与过量的探针1杂交，使结合在探针1上的镧系离子螯合物发生荧光猝灭，不被仪器检测到，降低了背景荧光，只测定游离的镧系螯合物的荧光强度，再通过标准曲线定量。

3.8与激光技术

联用激光-TRFIA是脉冲激光和荧光检测系统相结合产生的。于水等[10]利用7-碘-8-羟基喹啉-5-磺酸作荧光增强剂，在氢氧化钠强碱体系中，排除Ca、Mg、Al、Zn等干扰，建立了Cd的激光-时间分辨荧光测定方法；在pH3.0~6.5的HAc-NaAc缓冲体系中，通过添加柠檬酸钠掩蔽Al、Mg荧光干扰，建立了Zn的激光-时间分辨荧光测定方法。

3.9其他

钱昌顺等[11]建立了流动注射-时间分辨荧光联用技术，该技术具有快速、灵敏、准确等特点，能使常规的癌胚抗原（CEA）检测时间从几小时缩减至几分钟。随着计算机技术的发展，国外时间分辨荧光免疫测量仪器已经实现了高度自动化，操作软件也越来越人性化。国内几种相关仪器的推出也实现了硬件国产化。此外，光纤技术的引入，使TRFIA成为了一种新型超微量分析技术。

4应用

由于TRFIA灵敏度高，操作简便，无放射性污染等特点，其应用范围不断扩展，现已成为细胞因子测定、微生物诊断、核苷酸诊断、激素免疫测定等的重要分析手段。

4.1细胞因子测定

细胞因子不仅参与免疫应答反应，而且在肿瘤、炎症发生和发展过程中起着重要作用。因此，准确测定细胞因子含量，对于了解其病理生理作用十分重要。在细胞因子测定方面TRFIA逐渐开始取代RIA和酶联免疫分析（EIA）法。如测定CEA[12]、甲胎蛋白[13]、肿瘤相关抗原[14]等。

4.2微生物诊断

由于TRFIA灵敏度高，1979年其理论形成后，研究重点放在试剂开发和利用上，早期主要研制微生物诊断试剂。1982年研制用于测定风疹病毒抗体的TRFIA试剂。1986年开创了快速诊断流感的TRFIA方法。2002年，Sorensen等报道了同时检测弓形体IgM和IgA抗体的TRFIA方法，并将该方法用于筛查新生儿弓形体发病的情况。目前TRFIA已广泛用于各种传染病的诊断及研究，包括甲肝病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、脑炎病毒、A型流感、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等[15-16]。

4.3核酸诊断

铕标记的链霉亲和素-生物素探针，使核酸杂交整个过程变得快速、简单。目前，稀土元素标记探针技术已用于检测HIV、前列腺特异性抗原mRNA、腺病毒DNA、肺炎链球菌DNA和HLA-27等位基因，获得了满意的结果。

4.4激素免疫测定

Storch等[17]用TRFIA检测人血清胰岛素含量，史庭燕等[18]用它检测β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG），Wu等[19]检测血清中甲状腺激素等，其灵敏度优于RIA，是激素免疫测定的重大突破。现已用此法检测了促甲状腺激素（TSH）、α-轻孕酮、雌三醇、人促卵泡激素[20-23]、锁链素等[24]。TRFIA不仅被用于检测人血清激素，而且用于检测动物激素，李跃松等[25]用此法测定了尿微量清蛋白；Genderen等[26]检测了细胞提取液和培养基中的大鼠胰岛素；Parra等[27]检测了犬血清中的皮质醇和游离甲状腺素4（FT4）等。Harma等[28]改进了TRFIA测定前列腺特异性抗原（PSA）的方法，现在TRFIA已取代RIA、EIA等方法，检测项目涉及甲状腺激素、性腺激素、下丘脑分泌的激素、胰岛素、胃泌素等多方面。

5结语

TRFIA技术优点突出，随着研究的深入，应用日益广泛。TRFIA技术已在国际超微量分析技术领域展示了巨大的应用前景。我国由于起步较晚，还面临着一些亟待解决的问题：大部分检测试剂如螯合剂、增强液等需要进口，过分依赖国外产品；国产分析仪器尚有软件操作繁琐，界面复杂等缺点。这些都极大地限制了TRFIA技术的推广，还需科研工作者努力解决。

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