胶体金免疫层析法检测金黄色葡萄球菌的初步研究

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葡萄球菌广泛存在于我们生存的环境中．引起食物中毒的葡萄球菌主要是产肠毒素的葡萄球菌．其中以金黄色 葡萄球菌(& hylococcus alzreus，以下简称金葡菌)致病力最强，其能产生多种致病因子，其中金黄色葡萄球菌 肠毒素 (saphylococcus aureusentemtoxln．SE)耐热 100°C O．5 h[’。，一般的烹调方法不能将其破坏．通常在进食了有金葡菌及其肠毒素污染的食品．2-4h之内即出现临床 症状。被金葡茵污染的食物极易引起食源性疾病的爆发． 危害严重。因此。建立一种快速、简便的检测方法对及时控 制金黄色葡萄球菌性食物中毒有重要意义。为此．我们制 备了产肠毒素金葡菌的多克隆抗体，进而初步建立免疫胶 体金快速检测金葡菌的实验方法。
1 材料与方法1．1 材 料1．1．1 实验菌株及其培养金葡菌标准株(ATcc25923)、 大肠埃希菌标准株(ATCC25922)及铜绿假单胞菌标准 株(ATCC27853)为南方医院检验科芮勇宇博士惠赠：副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、耶尔森氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B型等菌株均为本室保存各菌 株均用 LB培养基大量培养．收获细菌。
1．1．2 实验动物2．5 kg左右健康雄性新西兰大白兔(许可证号：2002—009 2004B024 2004A062)，购自南方医科大 学实验动物中心。
1．1．3 主要试剂与仪器 羊抗兔HRP—IgG．羊抗兔 IgG购自北京鼎国生物技术公司；牛血清白蛋白(GIBCO)，其它 试剂均为国产分析纯试剂。ML902定时恒温磁力搅拌器为上海浦江分析仪器厂产品；GL20A全自动高速冷冻离心机为湖南仪器仪表总厂离心机厂产品；318MC型酶标仪为上海三科仪器有限公司产品
1．2 方 法1．2．1 抗血清的制备培养获得金葡菌，平板计数后，参 照文献 制备金葡菌菌体抗原，耳缘静脉注射免疫家兔。 免疫前由耳缘静脉取血 2 ml，分离血清，留作阴性对照。每次注射的金葡菌浓度均为 1×10mcfu／ml。第一、二次注射1．0 ml／只，第三、四次 1．5 ml／只，每次间隔4d。末次注射后 第 7天，耳缘静脉采血，用试管凝集法检测。当效价达1： 1600～1：3200时，颈动脉放血，分离血清。分装冻存于一2Occ【4．。 1．2．2 抗血清的纯化 间接ELISA法测定抗血清效价达 1：80000—1：160000，该抗血清与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌 0139型、耶尔森氏菌、大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC27853)、霍乱弧菌小川型及 569B型经间接 ELISA检测发现，与后5 种菌有交叉反应，采用吸收封闭法，再用饱和硫酸铵分级 沉淀法予以纯化_
1．2．3 胶体金颗粒的制备应用柠檬酸三钠还原法。 取 1％氯金酸溶液1 mI．加99 ml三蒸水煮沸，加 1％柠檬 酸三钠4 ml(37~C预温)，快速一次加入，继续煮沸至溶液 颜色由蓝变为酒红色为止。制得胶体金颗粒直径约 15 am。冷却后，用0．2 mol／LK2CO3调 pH至 7．2～7．5，用 0．45 m滤膜过滤，4~C保存。
1．2．4 确定最适蛋白浓度取9支试管各加1 ml胶体 金溶液。用 0．01mol／LpH7．2PB将纯化的兔抗金葡菌多 克隆抗体从 1：5对倍稀释至1：640，各取 100Ixl，按顺序加 入上述 8管胶体金溶液中，末管不加抗体，设为空白对照，混匀，5 min后于各试管中加 10％氯化钠100 ，混匀，室温静置 2 h后观察各管颜色变化。含蛋白量不足的管呈现 由红变蓝的聚沉现象．而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管中溶液保持红色不变。使红色保持不变的最低蛋 白含量即为最适蛋白量．在此基础上再增加 20％作为稳定胶体金的蛋白实际用量。
1．2．5 免疫胶体金的标记按上述确定的蛋白量取纯 化好的多克隆抗体，在磁力搅拌下缓慢加入 20 ml胶体金 溶液中，室温搅拌 30rain后加入 10％ BSA 0-8 ml(终浓度0．4％)，室温搅拌5min，再加入 10％ PEG 20000 0．4 ml(终浓度0．2％)，室温搅拌5 min。取 1ml胶体金一抗体结 合物溶液及 1 ml未标记胶体金溶液，各加入10％氯化钠1 ml。室温静置 1h，做稳定性检定。合格后，10 000 r／min，离心60 min，沉淀溶于 2ml保存液，0．45 Ixm滤膜过滤后，4~C保存。
1．2．6 免疫层析试纸条的制备r7_玻璃纤维膜、硝酸纤维 素膜 (检测带为1：10稀释的多克隆抗体．质控带为 1．0 mg／ml羊抗兔IgG)、吸水垫，依次贴于贴有双面胶的塑料底片上。膜以 1％BSA封闭后，以 O．02 mol／L pH7．4的 PBS洗 4次，干燥后，切成宽0．4 cm的小条，密封保存于4 备用。
1．2．7 胶体金免疫层析法检测步骤将上述试纸条插入 待检样品 100 l中，待试纸条完全浸润后，将其插入洗涤 液中，洗4次，再插入前述按1：10稀释的胶体金一抗体结 合物溶液 100 中。最终在试纸条上，检测带和质控带均有条带为阳性，仅质控带显色的为阴性，如质控带未出现 条带，则为体系失效 。
2 结 果2．1 抗体效价殛浓度所获抗血清试管凝集实验检测效价在 1：2 000左右． 同时用间接ELISA检测效价达1：160000，经吸收封闭及 饱和硫酸铵纯化，效价有降低，但仍在1：80000以上。蛋 白浓度为2．167 mg／ml。
2．2 胶体金标记及试纸条的标记试管观察法确定最适蛋白稳定浓度在 1：40，实际加入 蛋白浓度为6．5~g／ml，此浓度时。标记的胶体金可以保持 稳定。试纸条检测体系中的检测带浓度约为0．2 mg／ml，质 控带为1．0 mg／ml。
2．3 特异性抗体虽经吸收法封闭．但用此自制的试纸条分别对耶尔森菌、大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标 准株(ATCC27853)，霍乱弧菌569B型及小川型进行检测，发现仍与前三者有交叉反应
2．4 敏感性用无菌 PBS(0．02mol／L，pH7+4)配制金葡菌悬液，依 上法检测，结果表明其检测下限为 1x10％fu／m
讨 论免疫胶体金技术自1971年引入免疫化学之后，作为 一种新方法，因其具有反应迅速，耗时短；操作简单，不需 任何复杂的辅助设备和仪器；所需试剂和样品量很少．样 品不需特殊处理；实验结果能够长期保存：当抗体或抗原 特异性好时，结果的灵敏性和准确性好等显著优点，已广 泛应用于医学检验和诊断等方面。
般认为用于胶体金免疫层析试纸条制备时．至少应 有一个抗体是单克隆抗体，因为单克隆抗体具有很好的特 异性，但是相应的用于细菌检测时，单克隆抗体更容易出 现漏检．尤其是对于抗原结构复杂、分型多的细菌。本次实 验制备了兔抗金葡菌多克隆抗体，标记胶体金，自制胶体 金免疫层析试纸条，采用二步法，用于检测金葡菌。虽然与 耶尔森氏菌等三种细菌有一定的交叉反应．特异性欠佳， 但是检测灵敏性较好，可达 1×1 o6 cfu／ml，与同类实验检测 灵敏性相接近[4．。本实验建立的胶体金免疫层析试纸条法简便、快速、可行，特别适合现场应用。相信在今后的实 验中，通过提纯抗原，进一步纯化抗体等方法，可以提高抗体的特异性及检测的灵敏性，从而进一步优化反应体系． 甚至可以将几种食物中毒致病菌相关抗体点于同一膜上．实现一次检测同时得到一组结果[uA2]。这无疑将提高了免疫层析试纸条应用的实用性和广泛性，对常见细菌性食物中毒的初筛具有重要意义。