斑点免疫金渗滤法定量测定血清淀粉样蛋白A方法的建立及性能评估

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血清淀粉样蛋白Ａ（ｓｅｒｕｍａｍｙｌｏｉｄＡ，ＳＡＡ）是一类多基因编码的多态性蛋白家族，为组织淀粉样蛋白Ａ的前体物质，属急性时相反应蛋白。已有研究表明，在细菌、真菌、病毒感染，动脉粥样硬化，心血管疾病，急性移植排斥反应，肿瘤等疾病中均可检测到血清ＳＡＡ升高，对临床诊断有较好的参考价值。尽管如此，目前国内尚只有一种乳胶增强速率散射比浊法（ｌａｔｅｘｅｎｈａｎｃｅｄｒａｔｅｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ，ＬＥＲＮ）试剂经国家食品药品监督管理局（ＳｔａｔｅＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｉｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＳＦＤＡ）批准用于临床标本ＳＡＡ的检测，但由于其检测成本相对较高、需配套仪器等原因，ＳＡＡ检测尚未在临床中广泛应用。斑点免疫金渗滤法（ｄｏｔｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄｆｉｌｔｒａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ＤＩＧＦＡ）因其简便、快速、安全等特点在急诊医学、输血医学、现场诊断及个体自我体检等方面应用非常广泛，已经成为临床医学检验快速诊断（ｐｏｉｎｔｏｆｃａｒｅｔｅｓｔ，ＰＯＣＴ）领域中的主要检测技术。我们建立了基于ＤＩＧＦＡ的免疫金渗滤试剂板条（ＳＡＡＤＯＴ）定量测定血清ＳＡＡ并评估其分析性能。

材料和方法

一、材料

１．试验材料３株抗人ＳＡＡ单克隆抗体抗ＳＡＡ１、抗ＳＡＡ２和抗ＳＡＡ３购自ＨｙＴｅｓｔ公司（芬兰）。硝酸纤维素膜购自ＷｈａｔｍａｎＬｔｄ公司（英国）。人血清ＳＡＡ标准品购自英国国家生物制品检定所（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｄｓａｎｄＣｏｎｔｒｏｌ，ＮＩＢＳＣ，ＮＩＢＳＣｃｏｄｅ：９２／６８０）［１３］，使用时稀释至相应浓度。２．试剂和仪器ＮＬａｔｅｘＳＡＡ试剂盒为德国西门子公司产品，配套的测定仪器为ＢＮＰｒｏｓｐｅｃ特定蛋白分析仪；Ｑｐａｄ金标数码定量阅读仪（上海奥普生物医药有限公司）；ＡｖａｎｔｉＪＥ离心机（美国ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ公司）３．研究对象血清取自２０１２年４至５月瑞金医院体检中心２４０名表观健康者，其中男１２０名（年龄２１～５６岁），女１２０名（年龄２４～５８岁）。该２４０名体检者均无明显的炎症和感染指标，各项体检指标正常。
二、ＳＡＡ-ＤＯＴ的研制

１．胶体金溶液、免疫金溶液和反应板的制备参见文献。２．抗体的确定（１）抗体配对：商品化的３株单克隆抗体分别包被胶体金和硝酸纤维素膜，经组合得到６组配对，检测不同ＳＡＡ浓度的血清标本，根据反应曲线确定最佳的抗体对，分别用于标记胶体金和包被硝酸纤维素膜；（２）抗体工作浓度：最佳抗体对确定后，用７．５、１０和１５μｇ／ｍＬ抗体分别标记胶体金，用０．５、１．０和１．５ｍｇ／ｍＬ抗体分别包被硝酸纤维素膜，并组成９种组合。将此９种组合测定不同ＳＡＡ浓度的血清，根据反应曲线确定ＳＡＡＤＯＴ中抗体的最佳工作浓度。３．标准曲线制备ＳＡＡ高值血清稀释至５、１０、５０、１００、１５０、２００和２５０ｍｇ／Ｌ，每个浓度血清重复检测３次，取平均值绘制标准曲线。４．操作步骤的确定将血清用标本稀释液做１００倍稀释。在反应板上滴加２滴封闭液，待其完全渗入。取１００μＬ稀释后的血清加至一洁净Ｅｐ管中，再加入１００μＬ免疫金溶液，充分混匀，并将其全部加至反应板中；待完全渗入后，再滴加２滴清洗液至反应板。液体完全渗入后，将反应板条置于金标数码定量阅读仪上对反应斑点灰度进行检测，计算出血清中ＳＡＡ的浓度。
三、ＳＡＡＤＯＴ的性能分析
１．敏感性制备０、２．５、５、１０和２０ｍｇ／Ｌ的５个不同浓度的检测限样本及空白样本（０ｍｇ／Ｌ）做１０次批内重复测定，另外４个样本做天间重复测定，共做１０ｄ。定，共做１０ｄ［１４１５］。２．精密度分别测定２个浓度的血清样本（１０和１００ｍｇ／Ｌ）。批内精密度由１ｈ内重复测定２０次得到的结果计算。２份样本每天分别测定１次，连续测定２０ｄ，计算得到天间精密度。３．准确度回收试验根据文献配制系列回收血清样本，每份样本测定３次，结果取平均值，计算回收率［１５］。干扰实验根据中华人民共和国卫生部和国家标准化管理委员会颁布的《干扰实验准则》确定各干扰物及其浓度，胆红素为３４２μｍｏｌ／Ｌ、甘油三酯为３７ｍｍｏｌ／Ｌ、血红蛋白为２ｇ／Ｌ、防腐剂（０．５％ＮａＮ３），并配制干扰实验样本和对照样本。将此２种样本各重复测定６次，统计分析两者之间有无差异［１５］。方法学比对共测定４０份血清标本，随机分为５组。每天用ＳＡＡＤＯＴ和ＮＬａｔｅｘＳＡＡ试剂盒分别测定８份临床血清样本，每份血清检测２次，连续做５ｄ，每种方法得到８０个数据。４．线性范围的确定取浓度为１０和２０００ｍｇ／Ｌ的２份血清配制成８个浓度的系列血清，用于评价线性范围。每个浓度血清做４次重复测定，对试验数据进行统计处理，得到ＳＡＡＤＯＴ的线性范围。５．参考区间的确定２４０名表观健康者根据年龄分为２０～２９岁、３０～３９岁、４０～４９岁和５０～５９岁４组。每组根据性别再分为男、女２个亚组，每个亚组３０例。用ＳＡＡＤＯＴ测定各组血清，对结果进行统计分析，观察性别和年龄对ＳＡＡ浓度的影响，确定２４０名表观健康者ＳＡＡ的临界值和参考区间。６．血清样本稳定性将ＳＡＡ浓度为１５和１７５ｍｇ／Ｌ的血清分别在４和－２０储存，一定时间后进行检测，并与新鲜血清检测结果进行比较，观察ＳＡＡ在４和－２０中的稳定性。四、统计学方法采用ＳＰＳＳ１３．０统计学软件对数据进行统计学分析。正态分布时２组间比较采用独立样本的ｔ检验，多组间比较采用方差分析，线性范围采用直线相关分析；非正态分布时２组间比较采用ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙＵ检验，多组间比较采用ＫｒｕｓｋａｌＷａｌｌｉｓＨ检验，方法间比较采用Ｓｐｅａｒｍａｎ相关分析。Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结果

一、ＳＡＡＤＯＴ的检测参数

１．基本特性用于制备ＳＡＡＤＯＴ的最适抗体对为抗ＳＡＡ１和抗ＳＡＡ３。抗ＳＡＡ１用于标记胶体金颗粒，最佳工作浓度为１０μｇ／ｍＬ，每次测试免疫金溶液用量为１００μＬ。抗ＳＡＡ３用于包被硝酸纤维素膜，最佳工作浓度为１ｍｇ／ｍＬ，包被每块反应板的抗体用量为３μＬ。血清标本需先做１００倍稀释，每次测定用量１００μＬ。２．标准曲线ＳＡＡＤＯＴ标准曲线见图１，公式为Ｙ＝－１４．２５４Ｘ＋１０５２５，ｒ２＝０．９８２。该曲线为ＳＡＡ浓度在０～２５０ｍｇ／Ｌ时的标准曲线。当样本中ＳＡＡ浓度＞２５０ｍｇ／Ｌ时，需对样本稀释后再进行检测。二、ＳＡＡＤＯＴ分析性能１．敏感性ＳＡＡＤＯＴ的检测限试验结果显示，浓度为２．５、５、１０和２０ｍｇ／Ｌ样本天间ＣＶ分别为７０．３０％、２０．７７％、１２．４６％和１１．８９％。ＳＡＡＤＯＴ在测定５ｍｇ／Ｌ的ＳＡＡ样本时天间ＣＶ最接近２０％（为２０．７７％），所以ＳＡＡＤＯＴ的检测限为５ｍｇ／Ｌ。２．精密度ＳＡＡＤＯＴ重复测定１０ｍｇ／ＬＳＡＡ血清的批内和天间结果分别为１０．２±０．９２和（１０．５±１．１９）ｍｇ／Ｌ，计算得批内和天间变异系数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＣＶ）分别为９．０７％和１１．３３％。ＳＡＡＤＯＴ重复测定１００ｍｇ／ＬＳＡＡ血清的批内和天间结果分别为１０２．１±１０．４３和（１０３．０±１１．８８）ｍｇ／Ｌ，计算得批内和天间ＣＶ分别为１０．２１％和１１．５３％。３．准确度回收实验显示，ＳＡＡＤＯＴ的回收率为８６．４％；血清中含３４２μｍｏｌ／Ｌ胆红素、３７ｍｍｏｌ／Ｌ甘油三酯、２ｇ／Ｌ血红蛋白及０．５％ＮａＮ３对检测结果无明显影响（Ｐ＞０．０５）。方法学比对结果显示，用ＳＡＡＤＯＴ和ＮＬａｔｅｘＳＡＡ试剂盒检测ＳＡＡ的浓度主要分布于０～２００ｍｇ／Ｌ之间，对２组数据进行Ｓｐｅａｒｍａｎ相关分析，相关系数（ｒ）＝０．９９５（Ｐ＜０．０５）。见图２。 、
４．线性范围ＳＡＡＤＯＴ的线性范围为５～２３０ｍｇ／Ｌ，其回归方程的截距和斜率分别为ａ＝－０．７６６２，ｂ＝１．００９１，差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），见图３。

５．参考区间２４０名表观健康者ＳＡＡ测定结果见表１。ＳＡＡ浓度在各年龄组中呈偏态分布，故以中位数和９５％可信区间进行统计分析。各年龄组内ＳＡＡ浓度在男、女性之间无明显差异（Ｐ＞０．０５）；随着年龄增长ＳＡＡ浓度逐渐升高，５０～５９岁组ＳＡＡ浓度中位数和临界值均高于其他３组，但只与２０～２９岁组、３０～３９岁组差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５），而与４０～４９岁组相比，差异无统计学意义（Ｐ＜０．０５）。如果不考虑性别和年龄因素，所有２４０名表观健康者ＳＡＡ浓度中位数为５．７ｍｇ／Ｌ，９５％可信区间为０～９．６ｍｇ／Ｌ。将２４０名表观健康者根据年龄分为＜５０岁组和≥５０岁组，２组ＳＡＡ浓度中位数分别为５．３和６．２ｍｇ／Ｌ，９５％可信区间分别为０～８．２和０～１０．４ｍｇ／Ｌ。≥５０岁组ＳＡＡ浓度中位数和临界值明显高于＜５０岁组（Ｐ＜０．０５）。６．ＳＡＡ的稳定性在４放置９ｄ内检测结果稳定，第９天检测结果与第１天检测结果间差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５），但放置第１１天时的检测结果和第１天比较差异有统计学意义（Ｐ＜０．０１），见图４（ａ）、（ｂ）。血清于－２０条件下４个月内检测结果稳定（Ｐ＞０．０５），但放置第５个月时的检测结果与第１天的检测结果相比明显降低（Ｐ＜０．０１），见图４（ｃ）、（ｄ）。

讨论

目前，国内用于临床患者血清ＳＡＡ测定的商品化试剂较少，因此血清ＳＡＡ测定在临床疾病中的应用受到一定程度的制约。我们研制的ＳＡＡＤＯＴ基于ＤＩＧＦＡ，应用双抗体夹心法原理检测ＳＡＡ。由于每株抗体所针对的ＳＡＡ抗原决定簇不同，因此选择合适的抗体至关重要。经配对比较，最终选用抗ＳＡＡ１标记胶体金颗粒、抗ＳＡＡ３包被硝酸纤维素膜，其敏感性和线性结果较其他抗体配对组合更好。机体受炎症刺激后血清中ＳＡＡ浓度可达基础浓度的１０００倍，用双抗体夹心法检测ＳＡＡ浓度较高的血清样本时有可能产生Ｈｏｏｋ效应，此时需对血清预先稀释。虽然稀释倍数越高ＳＡＡＤＯＴ的检测范围越大，但较高的稀释倍数也会降低检测敏感性。实验证明，血清经稀释５０倍后即可避免由于ＳＡＡ浓度较高而产生的Ｈｏｏｋ效应，经１００倍稀释后既能满足常见临床样本的检测，也仍具有相对较好的检测敏感性。所以，我们选择将血清预稀释１００倍后检测。对于ＳＡＡ浓度较高的血清样本（＞２３０ｍｇ／Ｌ）需扩大稀释倍数后再测定，测定结果按相应稀释倍数计算获得。我们根据ＥＰ文件对ＳＡＡＤＯＴ的检测限、精密度、准确度、线性范围、参考区间等方面的性能进行了验证。２０％的天间ＣＶ是试验诊断所允许的最大不精密度，所以将天间ＣＶ为２０％或最接近２０％的检测限样本浓度作为检测系统可定量报告分析物的检测限最为保险，可确保测定结果是准确的［１４１５］。ＳＡＡＤＯＴ重复测定２．５ｍｇ／ＬＳＡＡ样本的天间ＣＶ为７０．３０％，重复变异较大，不能将２．５ｍｇ／Ｌ作为ＳＡＡＤＯＴ的检测限。ＳＡＡＤＯＴ重复测定１０和２０ｍｇ／ＬＳＡＡ样本的天间ＣＶ＜２０％。只有在重复测定ＳＡＡ浓度为５ｍｇ／Ｌ的样本时天间ＣＶ最接近２０％（２０．７７％），所以将ＳＡＡＤＯＴ的检测限设定为５ｍｇ／Ｌ较为合适。ＰＯＣＴ体外诊断试剂的ＣＶ须＜１５％方可用于临床患者样本的检测［１５１６］，ＳＡＡＤＯＴ的批内、天间ＣＶ均＜１５％，能满足临床患者样本测定的要求。由于高血脂、高胆红素和高血红蛋白对ＳＡＡ的检测无干扰，因此即使患者血清中这些物质含量较高，用ＳＡＡＤＯＴ检测仍能客观地反映患者样本中ＳＡＡ的含量。比对试验显示，ＳＡＡＤＯＴ与ＮＬａｔｅｘＳＡＡ试剂盒相关性较好，虽然少数高值样本用商品化试剂测定的结果较ＳＡＡＤＯＴ稍高，但是两者间差异无统计学意义。这种差异可能是由于两者的方法学不同、检测所用抗体不同（ＳＡＡＤＯＴ为单克隆抗体，ＮＬａｔｅｘＳＡＡ为多克隆抗体）等原因所致。线性范围是评价检测方法在此范围内检测不同患者样本的结果是否能反映患者样本中的真实水平［１５，１８］。本研究ＳＡＡＤＯＴ在５～２３０ｍｇ／Ｌ范围内的检测结果可真实反映患者血清ＳＡＡ浓度。参考区间的确立对于检验项目运用于临床至关重要。本研究结果显示男、女之间ＳＡＡ浓度差异无统计学意义；但随着年龄的增长，ＳＡＡ浓度逐渐升高［２０］。提示在实际应用中应确立各年龄段的参考区间，充分考虑年龄因素对ＳＡＡ浓度的影响。血清样本的保存是医学检验工作中的重要环节。根据试验结果并考虑到临床操作的可行性，我们建议尽可能取新鲜血清样本进行测定，并且在４保存时间不应超过７ｄ。如果样本需要长期保存，则应在样本采集后２４ｈ内即于－２０下储存（可长达４个月），在此期间应避免反复冻融。我们制备的基于ＤＩＧＦＡ的试剂板条ＳＡＡＤＯＴ的分析性能达到了相关检测标准，检测方法简便、快速，可满足临床样本检测的要求。