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[讨论] 分析灵敏度(检测限)

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发表于 2019-9-20 09:24 | 显示全部楼层 |阅读模式

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近年来,在来稿和文献中就分析灵敏度性能的 含义众说不一,如不深入讨论,真正理解,很易误 导。本刊不得不在审稿时要求作者说清楚,来稿中 所说的灵敏度的确切含义是什么,是怎样做实验得 出结果的。好在今年对前列腺特异蛋白检测的标 准化已有了说法,这样针对微量蛋白的分析灵敏度 也就明确了。以下介绍的内容和核酸检测方法灵 敏度的理解可能有差别,但是原则应是一致的。
一、分析灵敏度(检测限)
!,可检测的最低分析物浓度为检测系统的分析灵敏度或称检测限。这个浓度限值对毒品检验 在法庭上特别重要,希望通过检测知道样品中究竟有无药物,这是很关键的。另外,肿瘤标志物及许 多特定蛋白应该有一个可检测的最低浓度或某个量;如:前列腺特异蛋白(-.*),这是病人治疗后监 视复发的重要信息;长期来,临床对报告的前列腺特异蛋白究竟有意义的最小量要求予以明确。核 酸检测报告的阴、阳性也要求说明,能检出的最小 拷贝的核酸量或相当于多少病毒。因此,确定检测系统的可报告低限是重要的分析性能。
$,当前,检测限术语混乱。厂商使用各种词 语,如:灵敏度,分析灵敏度,最小检测限(92129:9;030832<1729#23),功能灵敏度,检测限度,定量限度 等。迄今尚无标准定义,所以有必要了解每个词语 的实际含义和确定这个含义的实验方式,怎样处理数据,怎样由数据作出估计,以及这个估计对该检 验的医学应用是否有用。以下介绍的分析灵敏度分为具有定性含义的检测低限,和具有定量含义的生物检测限及功能灵敏度。
二、检测低限
每次检测,总是做一个空白样品。检测方法常 以空白响应量校准至零点,再检测各个检测样品的 反应响应量。这些样品的反应响应量在扣除了空 白样品响应量后,是分析物的对应响应量。但是, 空白响应量也有波动。若重复多次作空白检测,以 空白(响应量)均值和标准差表示这些空白响应量 的平均水平和所有空白响应量对于空白均值的离 散程度指标。在确定方法性能或绘制标准曲线时, 常常以空白均值表示空白响应量。实际工作时,每 次只做一个空白,这个空白响应量各有50%的可 能性,大于或小于空白均值。当空白响应量小于空白均值,对同一个样品检测响应量(未扣除空白响 应量),似乎反映分析物要多一点,检测方法好象灵敏些。当空白响应量大于空白均值,似乎原先可以 检测出来的分析物现在测不出了。因此,检测方法必须说清楚:究竟怎样才算是可检测出来的分析物 量?标准曲线从零开始,是不是报告的分析物量可 以从零开始?这就是检测低限要回答的问题。统计说明,如果空白响应量的波动服从正态分布规 律:各个单次检测的空白响应量!空白有95%的可 能性为:
1.jpg 其中较空白均值小的一半会使分析物更易检 测出来,这不是检测不出,不必考虑。若有一个检 测响应量较空白响应量均值大$#空白,仍然认为是 空白响应量的可能性只有5%;有95%的可能性属于样品内有分析物形成的检测响应量;它较空白均值差!!空白 以上。同理,响应量较空白均值相差 "!空白以上的,还认为是空白响应量的可能性仅 #$"%;而有&&$’%的可能性是样品内有分析物形成的响应量。所以若检测样品的反应响应量较空 白均值大的,但和空白均值相差!!空白 或"!空白 以下的,只能说这些响应量是空白样品单次检测的响 应量,样品内没有分析物,或者表示:分析物量为零。超过!!空白或"!空白的响应量才认为样品中真 的含有分析物。
检测低限定义为样品单次检测可以达到的检 测响应量对应的分析物量。检测系统或方法对小 于或等于检测低限的分析物量只能报告“无分析物检出”。通常估计95%或99.7%的两种可能性:
2.jpg 要注意的是,直接读出浓度单位的检测系统对 低于零的检测将报告零,其分布不是正态的,因此 计算的均值和标准差不能如实表达检测低限的真 实情况。若检测响应可以初始值表示,如:吸光度、 荧光、等,此时!空白是有效的。所以应使用初始值来计算均值和标准差,然后再转换成浓度单位。
三、生物检测限度
大于检测低限的响应信号说明这个样品内有 分析物,但是方法还不能正确报告定量结果。因为 在这样低的浓度或其他量值的范围内,单次检测样 品的反应响应量重复性较差。那么在多少检测响 应量时才能较好地报告定量结果呢?现介绍两种 方式:生物检测限度和功能灵敏度。原则上,对多 个近于检测限浓度的样品(肯定不是空白样品)作 重复检测,对扣除了空白响应量后的样品检测响应 量以均值和标准差归纳。按正态分布规律,单次检 测样品具有的响应量有95%或97’%的可能性和 检测响应量均值相差!或"倍的响应量标准差。较均值还大的单次响应量肯定没问题;但是较均值 小的那些单次响应量,若和检测低限(空白响应量上限)交叉,说明检测方法还不能单凭一次检测区 分出这是空白还是有分析物。因此,这些样品检测响应量的95%或97’%单次检测量最低值也较检 测低限大,这样就可保证样品在任何情况 下,单次检测响应量一定不是空白的响应量;这个样品具有的分析物浓度可以定量地报告出来。在多个近于检测限的样品中,符合这样条件的最低分 析物浓度(或其他量值)就是检测系统或方法的生物检测低限。
生物检测低限定义为:以检测低限加!或"倍检测限样品标准差的方式,确定检测系统或方法可 定量报告分析物的最低浓度或其他量值的限值。生物检测低限的具体度量方式为:
3.jpg 本词语较完善地表示实际样品的检测限度, 如:什么浓度才是和零值或没有分析物有差异。在 证实厂商的+)*说明时,应使检测限样品的浓度 和厂商的说明相同。
四、功能灵敏度
功能灵敏度定义为:以天间重复 => 为!#%时对应检测限样品具有的平均浓度,确定检测系统 或方法可定量报告分析物的最低浓度或其他量值 的限值。为了估计69,须用多个检测限浓度来确定在低浓度处的精密度表现,从中选择具!#%=> 的浓度。在证实厂商的69的明时,使用的检测限样品浓度应和厂商的说明相同。
五、实验须考虑的因素
一般制备两种不同类型的样品。一个是“空白”样品,即不含有分析物,分析物浓度为零。另一 个是“检测限”样品,即含有低浓度的分析物。在有些场合下,需要制备几份“检测限”样品。空白和检 测限样品由检验方法作重复检测。计算各自的均 值和标准差。不同的检测限由空白和检测限样品数据计算出来。
1.空白液:一份空白液用作空白,其他用于制 备检测限样品。理想的空白液应具有和检验的病 人样品相同的基体。但是,常使用检测系统的系列梭准品中的“零标准”作为空白。对某些项目,可使 用术后已无某疾病的病人样品(如:前列腺肿瘤术后病人的无@9A血清)为空白样品。
2.检测限样品:在证实某方法的灵敏度性能 时,对空白液加入分析物配制成检测样品。加入的 分析物量应是厂商说明的检测浓度。在建立检测限度时,有必要制备几份检测限样品,它们的浓度 应界于预期检测限度高低一些的范围内。重复检测数:没有具体规定,但常推荐做10次。符合临床 检验对重复检测实验的要求。厂商常推荐20次,为减少开支。实验室也常采纳作10次。
3. 实验需要的时间:如果主要从空白液的重复 性了解检测低限,常常就做批内或短期实验。如果主要从“检测限”样品的重复性了解定量的检测限, 推荐作较长时间的实验,代表天间测定性能。实际就做10次检测(10d)
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