糖化血红蛋白的检测和临床应用

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目前，糖化血红蛋白(glycosylatedhemoglobin，GHb)作为糖尿病筛选、诊断、血糖控制、疗效考核的有效检测指标，在临床中得到了广泛地使用，其理由也许有二个：(1)HPLC法测定GHb使其准确性和重复性得到很大的提高，(2)1993年美国1型糖尿病控制及并发症试验(DiabetesControlandComplicationTrial，DCCT)和英国大规模的2型糖尿病控制与并发症关系研究(uKPDs)的研究中把GHb作为糖尿病控制的一个观察指标。1996年4月起在日本GHb被纳入老年人保健法中糖尿病筛选的检查项目…。2002年美国糖尿病协会(ADA)已将其作为监测糖尿病血糖控制的金标准，对其应用也做出了明确的规定：即所有糖尿病患者均应常规测定Alc。其初诊时测定结果为基线时的代谢状况。此后的测定值则作为糖尿病长期治疗控制中的一部分。控制稳定者(HbA1c<7％)，每年至少测定2次，而对治疗方案变动或血糖控制未达标者，则需季度监控检测。这样在提高糖尿病诊断水平，血糖控制、慢性并发症的防治中具有十分重要的应用价值，但目前全面地认识GHb的相关知识仍有其必要性、必需性，为此我们就GHb作一简单的阐述。

一、GHb的发现和结构

在研究异常血红蛋白(Hb)的过程中发现了GHb，当时利用琼脂糖电泳法进行血红蛋白物理、化学性质的分析。在pH7．0的条件下电泳，向阳极泳动速度最快的是血红蛋白的主要成分HbA。结果在糖尿病患者标本中发现了过于浓集的HbA电泳区带，于是在1962年提出了糖尿病性血红蛋白一词。同样的情况，也在其他的研究者中被发现。Huisman等在用甲苯磺丁脲(甲糖宁)治疗糖尿病(DM)的过程中发现了糖尿病患者中存在着这种异常的Hb成分，而所谓的这种异常Hb全是从糖尿病患者的标本中发现、分离，被命名为糖尿病性血红蛋白成分(Diabetichemoglobincomponents)。以后进一步用高分辨的层析法对这些异常成分再分离，纯化，再经胰蛋白酶消化和肽酶解图谱法(指纹图谱法)处理，其主要部分被确认为HbAlc。HbA1C并非糖尿病患者所特有，在正常人血浆中也存在，但仅占总血红蛋白的1％～4％。Schroeder从分离柱中分离出A1a，A1b，A1C，A1d，A1e的微量成分以及A，AaAIIIb，同时还提出了HbAlc是HbA(由2条141个氨基酸组成的a链和2条146个氨基酸组成的链构成的四聚体a)中被糖类所修饰的成分，犹如a。(：N末端和糖类相结合的链)。

GHb的结构中60％是B链N端缬氨酸和葡萄糖相结合的序列，而40％为其他氨基酸的序列。其他氨基酸残基与葡萄糖的结合亲和力的顺序从大到小依次为；a一赖氨酸一16，p一赖氨酸一66，p一赖氨酸一17。a一缬氨酸一l，a一赖氨酸一7，p一赖氨酸一120。Glib不仅是HbB链的N端缬氨酸和葡萄糖结合，其他特定的氨基酸也可和葡萄糖结合形成化合物。

通常指的HbA1C为Hb的色谱分离中的一个成分，并非为一个特指物质，只是和葡萄糖相结合的Hb才被称为GHb，而现在临床上把HbA1C和GHb常作为同义词。HbA1C是8链N端缬氨酸与葡萄糖进行的非酶缩和反应，先形成不稳定的Shift碱(醛亚胺，或称前A1C)，然后经过Amadori重排，形成稳定的酮胺化合物HbAlc。

Hb肽含有可同l1个葡萄糖相结合的位点。具有化学活性的血中葡萄糖的非环状的链状结构仅占0．001％，通常其浓度约为5×10mol／L，GHb的形成受到葡萄糖浓度的影响。血中的GHb浓度表示了血糖浓度的中长期的平均值。同时如按反应速度论计算，人的正常状态时血中葡萄糖mM相当于酮胺浓度的l％和醛亚胺浓度的0．14％。

二、测定方法

测定GHb主要是利用GHb和Hb的物理化学性质的不同而进行的，目前主要的测定方法有三种：

1．离子交换高效液相色谱分析法 用弱酸性阳离子交换树酯，在选定低浓度洗脱液的离子强度及pH条件下，由于Hb中各组分蛋白所带电荷不同而分离。GHb几乎不带正电荷，首先被洗脱；HbA带正电荷，再用高浓度洗脱液洗出HbA，得到相应的Hb层析谱，其横坐标是时间，纵坐标是百分比。HbA1c值是以HbA1C的部分面积在全Hb面积的百分率来表示，现在都用全自动测定仪来测定，如日本TOSOH公司生产的全自动糖化血红蛋白分析仪曾应用于美国DCCT研究，其离子交换HPLC法是HbA1C检测的金标准，当前推出的最新型糖化血红蛋白分析仪——HLc一723G7。从开机到报告第一个结果仅需3．6min，标本无需前处理，操作维护都非常方便。

2．硼酸亲和层析法 用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间氨基苯硼酸(maminophenyl—boronicacid)的琼脂糖珠。硼酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质，致使GHb选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱而分离测定l|。

3．免疫测定法利用抗原、抗体反应的原理测定GHb 以血红蛋白B链糖基末端的最初4个氨基酸残基作为抗体识别位点。HbS、HbC和HbE的突变点分别在B一链上的6号、26号位，因此上述血红蛋白的变体可对HbA1C柃测结果造成影响所以单纯地作为糖尿病血糖水平的判断指标也许问题不大，如欲同时作为研究异常Hb症就不合适．

综合现在临床实验室中常用的GHb测定法，因为不同的原理，同一标本得到的测定值也不相同。Garliek，Could等用亲和层析法测得健康正常人为(7．4±0．6)％及(7．31±0．92)％，而HPIC测得值为(4．1±0．4)％。这就涉及到一个常述的标准化问题，此外GHb的定义不统一，其标准物质及标准测定法也没有明确的确立。这有待于进一步研究解决。

三、GHb的临床评价

红细胞的平均寿命为120d，在红细胞存活的过程中，血中葡萄糖浓度会有或多或少的波动，红细胞越接近死亡，其血红蛋白与葡萄糖的接触时间也就越长，即GHb含量就越高。在红细胞平均寿命(120d)一半时段中所测得的平均血糖值与HbA1C最吻合，所以HbA1C值能反映过去1～2个月间的平均血糖值。但关于血糖的某一时点，或某一时段与HbA1C相关性最佳的认识并未得到统一。HbA1C和血糖的关系仍然是临床上所存在的争论点。除了时间关系我们也要注意到量的关系，如果在同一时点把GHb和平均血糖值作比较，在评价时就会发现问题。根据DCCT的研究结果，以278名2型糖尿病患者为对象．从1日7次以及1年4次的测得的平均血糖值及相对应GHb的结果中发现GHb若有1％的变化，则平均血糖值的差别约为30mg／dl。如在Glib为7％与9％时其相应的平均血糖值则差60mgi'dL见表1。

表2列举了日本的糖尿病学会治疗指南中的正常参考范围J。共调查了725名正常人(男380名，女345名)。这被调杏者是通过75g的OGTT筛选出来并符合日本糖尿病学会的正常人标准，其血液Hb、血清肌酐的浓度正常。

这里我们依据DCCT资料在表3中列举了HbA1C值与各时期血糖值之间的发生和发展关系。

长期持续的高血糖症不仅使血红蛋白发生糖基化，且长寿组织蛋白也发生非酶糖化，生成糖化终产物(AGEs)。AGEs刺激糖脂及蛋白质的氧化应激产物(ROS)的产生。血管内皮细胞损伤，细胞间基质增殖等，成为糖尿病的眼，心，肾，神经等并发症发生的重要机制之一。所以血糖控制与糖尿病并发症，特别是微血管病变的发生，进展有着密切的关系。1441名的1型糖尿病患者(年龄13～39岁)分成2组，一组为强化胰岛素治疗，另一组为常规治疗，GHb在常规治疗中为8．5～9％，平均血糖值(231±55)mg／dL，而强化治疗为7％，平均血糖值(155±30)mg／dL，这样的差值明显影响并发症的发生和进展。有结果表明如果GHb值降低1％，视网膜病变的发生率约降低40％，所以强化治疗法大大优于常规疗法J

目前通常认为HbAlc测定的临床意义有(1)在糖尿病的筛选普查中有早期提示的价值，可作为轻症、2型、“隐性”糖尿病的早期诊断指标；(2)在糖尿病的治疗血糖监控中可作为参考、治疗指标：(3)预示微、小血管并发征。在以DCCT和UKPDS为代表的对糖尿病患者的临床测试数据显示，糖尿病的根本核心问题是心血管的并发症，出现于糖尿病的早期或前期，所以临床上就要求对糖尿病的诊断标准不仅仅是有利于糖尿病的早期发现，更应利于糖尿病并发症的早期发现和预防。相信随着对HbAlc实验方法标准化的重视和提高，HbAlc在增加对糖尿病的诊断，提示并发症的敏感性和特异性等应用方面有着独特的作用。

四、影响因素和展望

血液病患者尤其是溶血性贫血的患者，其红细胞寿命缩短，导至GHb形成的时间也相对应缩短，由此测定的结果就会受到影响，所以当某些基础疾病存在继发性溶血现象，往往使GHb测得值偏低，如肝硬化、脾肿大、糖尿病性肾病患者的EPO治疗以及极度贫血患者的输血治疗后等。同时因测定方法的不同，受到的干扰也不相同。肾病患者体内过多的尿素生成，其代谢产物结合于Hb的a链及／3链N端的氨基，形成氨基甲酰Hb(carbamylHb)，主要分离出HbA1a+b，HbA1C及HbAo，此时测得的GHb偏高(HPLC法)，而慢性酒精中毒患者因生成乙酰醛的结合物，也会引起结果偏高，然而免疫测定法却不受于扰。

血红蛋白珠蛋白链结构异常和合成不均匀会导至异常血红蛋白的产生。虽然异常血红蛋白的存在未必有一定的临床表现，但HbS、HbC、HbE的突变点若分别发生在口链的6号、26号位，在用HPLC法和免疫法测定HbAlc时会有一定的干扰，这也应注意。

异常血红蛋白的检测、确认可用DNA分析法，这一方法在少数实验室中被应用，也有研究者使用电喷离子质谱(electros．prayionizationmassspectrometry，ESI—MS)法测定HbAlc。同时被认为用ESI—MS测出的HbAlc是真正的HbA1c，且结果也要低于目前临床习用的各种常规方法。但其昂贵的仪器在实际工作中很难广泛应用。也有研究者[]在日常检查中应用测定仪T()SOHHLC一723G7设定其检测异常Hb的梯度，可分离出异常Hb。

展望GHb的测定，也许其测定的标准化并未得到人们的真正重视，今后应加强这方面的研究。