反转录巢式PCR( RT-nested PCR)标准操作流程及注意事项

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一、引言
反转录巢式PCR( RT-nested PCR)是在反转录PCR的基础上发展起来的,在通过反转录获得cDNA的基础上,对目的基因进行巢式PCR扩增。它和简单的反转录PCR一样是用于检测某种RNA是否被表达,或者比较其相对表达水平,但是特异性更高、可靠性更强。通常用于拷贝数较低的RNA的扩增,种RNA是否被表达,或者比较其相对表达水平,但是特异性更高、可靠性更强。通常用于拷贝例如扩增丙型肝炎病毒(HCV)感染者体内的HCV基因。
二、材料
①模板:总RNA或mRNA。
②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L
③四条特异引物:两条外引物,两条内引物,浓度均为10pmol/L。
④ Tag DNA聚合酶及其10×PCR缓冲液。
⑤反转录酶及其10×缓冲液。
⑥RNA酶抑制剂
⑦高压灭菌去离子水
⑧用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。
三、方法
1.引物设计
在进行反转录合成时,可根据不同需要选择下列引物。
(1)随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA,例如rRNA、mRNA、tRNA等,主要用于单一模板的 RT-PCR反应
(2) oligo(dT)适用于具有poly(A)尾巴的RNA[原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有poly(A)尾巴]。由于 oligo(dT)要结合poly(A)尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少
(3)基因特异性引物与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况获得cDNA模板后,进行巢式PCR的引物设计方法同普通的巢式PCR一样。
2.模板
利用试剂盒、 Trizol等提取的总RNA或mRNA
3.操作方法
(1)反转录反应反转录反应可以利用 oligo(dT)或随机引物引导。如果需要由3'poly(A)区域引导,选用 oligo(dT)3引物;如果需要引导全长RNA,选用随机引物。当使用cDNA进行克隆及PCR反应时,通常选择 oligo(dT)1引物。如果cDNA用于 RT-PCR,有时随机引物比较合适,特别当PCR引物定位于RNA5末端时更是如此
将1RNA[poly(A)+mRNA或总RNA]加入微量离心管中并于70℃温育10min,短暂离心后置于冰上。依照下列所列顺序,加入以下试剂以建立一个20l的反应体系。
(依据RNA的量,反应体积可以增减）
MgCL2   25   mmol/L                           4 ul           AMV反转录酶(高浓度)             15U
反转录10×缓冲液   2ul         oligo(dT)15引物或随机引物            0.5ug   
dNTP混合物,10 mmol/L        2 ul                  RNA模板          1ug
重组的 RAsing核糖核酸酶抑制剂0.5ul              加无核酸酶的水         至20ul
如果使用 oligo(dT)15引物,将反应体系于4℃温育15min。如果使用随机引物,将反应体系于室温温育10min,然后于42℃温育15min。增加的室温温育步骤有利于引物的伸展,使得当温度升高到42℃时引物仍处于杂交状态。
然后将样品于95℃加热5min,然后于0~5℃放置5min。这一步将使AMV反转录酶失活并阻止其与DNA结合。第一链cDNA可用于第二链cDNA的合成或PCR扩增,也可以将第一链cDNA存放于-20℃备用
(2)巢式PCR反应
①设立501的PCR反应体系,在0.25ml的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液                   5 u cDNA模板                      5ul
2.5mmol/L的dNTP混合液        1 I Taq dnA聚合酶(5Ul)         0.5gl
10mo/L的外引物(P1、P2)各1ul         H2O          至50ul
如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50μ)。将PCR试管放入到PCR仪上。
②设置PCR反应条件。

PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成10bp左右
③进行第二轮PCR反应,在0.25ml的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液               5ul           第一轮PCR产物         5ul
2.5mmol/L的dNTP混合液     1 ul      Taq dNA聚合酶(5U/1)     0.5l
10ymol/L的外引物(P3、P4)      各1pH2O           至50pl
PCR反应条件同第一轮。
④PCR产物的检测
反应结束后,用10第二轮PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
四、注意事项
①在反转录反应中,可以用特异性下游引物(由使用者提供)代替 oligo(dT)引物或随机引物。特异性引物的浓度应根据反转录的种类进行调整。例如,当使用一个24个碱基的引物与1.0g的模板RNA杂交时,需要800ng(100pmo)引物。当相同的引物与总RNA样品中的特异性RNA杂交时,只需要少至120ng(15pmo)引物。特异性引物的典型长度为19~30个碱基。
②为了得到更长和(或)更丰富的转录本,可以将cDNA反应于42℃,温育时间延长至60min
③在CDNA合成时,与MMV反转录酶相比,AMV反转录酶的用量要少很多。
④已经证明,提高反转录的温度(45~50℃)可以解决RNA二级结构的问题。
五、应用
反转录巢式PCR在分子生物学实验中具有广泛的应用。通常来说获取拷贝数较低的基因,这是一个很好的选择,在获得RNA病毒基因方面,它是一个很好的工具。王艳等利用反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒,通过反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎惠者标本中存
在SARS相关冠状病毒的序列,表明该方法是一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。杨静慧等口利用两轮多重反转录巢式PCR方法扩增了草莓全长GaUR基因。

黄先生

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