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[分享] PCR实验经验交流(1)

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发表于 2018-8-30 00:46 | 显示全部楼层 |阅读模式

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PCR实验经验交流(1)
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1.PCR实验耗材需要高压灭菌吗?
不进行细菌或细胞培养的实验耗材,所用的Tip头和离心管无需进行高压灭菌处理!因为这些耗材都是从塑料颗粒热压塑形出来的,并不存在实验污染的病原核酸,由于高压并不能使DNA酶和RNA酶完全失去活性,反而高压会使Tip头和离心管发生变形,导至使用时封闭不严,严重影响实验效率和实验质量,而且高压灭菌过程也可能是污染传播的过程。



2.血清(血浆)样本中HBV、HCV和HIV的稳定性有何差别?

血清HBV的稳定性最好,一般100IU/mL的血清样本于-20℃保持5年,稳定性良好;血清HCV稳定性最差,1000IU/mL的血清样本,放置在室温(18~25℃)3天即降解到15IU/mL以下,但不同用药患者降解速度似乎不同,如使用索菲布韦治疗的HCV患者离体血清,降解似乎速度更快!这种治疗后的HCV阳性血清稳定性资料尚未查及,是很有价值的研究素材。血清中HIV的降解速度要比HCV慢的多,我们曾对1000IU/mL的HIV阳性血清样本进行稳定性研究,室温放置1周尚能持续检测为阳性,这和大家的习惯性观念大有不同。因此,无论临床检验还是实验室制备室内质控品,都应考虑样本稳定性的差异,特别是药物的干扰和影响。




3.高压灭菌、紫外照射、酒精喷洒和有效氯处理哪种清除污染最有效?
    我们对纯化的基因组核酸和扩增产物制备成一定的浓度,分别采用高压灭菌、紫外照射、酒精喷洒和有效氯浸泡的方式进行处理,然后对处理样本进行核酸纯化和PCR扩增。多次验证结果表明,高压灭菌和酒精喷洒对核酸污染的清除没有任何作用,反而会使污染扩散。紫外照射对扩增产物造成的污染有一定的效果,但及其有限。但采用0.2%~0.5%的有效氯消毒液浸泡,对核酸污染的清除效果非常显著,实验表明,按以上终浓度的有效氯消毒液处理半小时,可以使104IU/ml的基因组核酸下降到20IU/ml以下。
4.PCR实验室不分区就一定会发生实验室污染吗?

PCR分区的目的是避免交叉污染,不同房间的分割强迫不同物品专用,在某种程度上避免了直接接触污染的风险。国内不同医院的PCR实验室条件各有不同,但实验室发生污染的概率似乎与实验室是否分区没有关系,有的实验室严格安三室或四室要求进行建设,甚至设置净化设施,污染不但没有完全避免,而且清除很困难;有的实验室虽然在PCR实验室验收时勉强过关,但临床PCR基本都在一个房间进行,实际情况却是一个房间的PCR污染的发生率并不比标准实验室高;结合罗氏COBAS“一体机”的情况其实并不难理解,实验室硬件建设固然重要,但关键的因素还是“人的专业素养和水准”,如果操作的“人”能清晰污染来源的“关键点”,在什么样的场所做PCR实验似乎并不重要!当然,在没有官方许可和形成专业的防污染意识前,还是应按照强制性分区进行工作比较稳妥!


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发表于 2018-11-18 20:43 | 显示全部楼层
关于污染,手套要勤换,至少不能从II区带到I区,
另外门把手,电泳房和质粒房出入一定要注意。
次氯酸除核酸这一点很重要,清洁时要用来擦移液器,台面等。。
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发表于 2022-8-15 14:45 | 显示全部楼层
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