几种PCR产物的分析方法

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PCR扩增产物的克隆
平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR产物直接进行连接。载体可用EcoR V或SmaI切成平头；PCR产物纯化后，可以在22用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。
如果要求不高，PCR产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New EnglandBiolabs公司的VentDNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG8000，也只能很有限地提高效率。
通常情况下，PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接，但其连接效率效低。因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能在两6条DNA链的3'末端加上一个多余的碱基，使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子。
这种DNA分子的连接效率很低。由于PCR产物的效率通过较高，在采用大量T4 DNA连接酶并配以5-10u T4RNA连接酶时，可显著提高其连接效率。
对于较短PCR产物，用PUS19的Hinc位点进行克隆，以X-gal和IPTG筛选，常可得到足量重组子。另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA，然后再用平端连接法克隆PCR产物。
PCR扩增产物分析
PCR扩增产物有微孔板夹心杂交法、颜色互补分析法、PCR-ELISA法、PCR-OLA法、PCR-打点杂交法等方法
微孔板夹心杂交法： 　　该法是通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交使产物的间接地固定于微孔板上，然后，再用一生物素 等非放射性标记物标记的检测探针与产物的另一特异性较一次杂交，漂洗后显色即可判断结果。该法需要两个杂交过程来检测 一个产物，因此，其特异性较一次杂交的检测法高。该法已用于HBV的检测，其敏感度可达5个HBVDNA 分子。此法的敏感性和特异性与 PCR32P探针的Southern杂交法相当。但PCR微孔板夹心杂交法操作简 便、快速、避免了同位素标记探针的危害，显色反应类似于临床常规应用的ELISA，适于临床实验室常规应用。另一种微孔板杂交法不 是采用夹心法，而是直接将特异探针固定微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物杂交。微孔板杂交与膜印迹杂交相比，有如下优点： 前者易操作；固相微孔板漂洗时间短，节省了检测时间，因为膜杂交过程中，反应剂要浸透膜中，漂洗时，使反应剂全部浸出需 要时间较长；本底低，微孔板杂交不需Dehatdt液和预杂交以及封闭过程。另外，微孔板固定的DNA 不需再加热或UV照射。
颜色互补分析法是利用三原色原理，当不同DNA 片段（A和B）同时扩增时，用引物5’端修饰技术将不同引物用不同颜色荧光素标记（A片段引物标记绿色的荧光素，B标记红色的罗丹明）。如果仅有一条片段被扩增，扩增产物激发后，只有一种颜色（红色或绿色）。如果两条不同大小的片段均被扩增，可通过电泳分离，紫外激发后可观察到不同颜色的两条带。如果两条被扩增片段大小相同，电泳后可见一条红绿互补色-黄色带。如果不用电泳法分离扩增片段，通过一定手段除未掺入引物，亦可观察到扩增产物的颜色。此时，扩增产物无论大小，只要均被扩增，就可见 一条红绿互补的黄色条带。　　该法简便、易于自动化，可用于检测基因，缺失、染色体转位和病原微生物。这种情况下，只需判断产物的有无。另外，在检测多种基因实变、多种病原菌和HLA分型时，可用复合PCR。此时，不同引物可用不同荧光素标记（如绿色的ROX；蓝色的COUM 等）。
PCR-ELISA法：(A) 　　本法避免了电泳和杂交的步骤，适于常规ELISA记数仪检测。因为5’端修饰后仍可进行常规PCR扩增特异靶序列，因此，可以通过修饰其中一个引物的5’端使其携带便于PCR产物固定的功能基团，而通过另一引物5’端的修饰使产物便于检测。 PCR-OLA法(A) 　　研究表明、不同个体中同源DNA片段序列间的差异大部分是限定于单个核苷酸的位 置。已弄清的人遗传病的40个基因结构变异中，绝大部分属碱基替换，同样，作为遗传连锁分析标记的大部分序列变异主要是位于基因组的非编码区的点突变。所以，一般基因检测技术的一个重要要求是能很容易地检出单一核苷酸变异。寡核苷酸连接试验（OLA）就是为此目的而设计的。它可以单独或结合PCR快速确定紧密相关的DNA 序 列。 　　OLA是通过设计两种能与靶序列DNA精确并列杂交的寡核苷酸完成的。寡核酸杂交 后，DNA 连接酶可使其正常配对的相邻碱基共价连接，而错配的相邻碱基可通过调节连接酶和NaCl浓度防止其连接，连接产物可通过凝胶电泳观察其大小，或通过5’端修饰技术使一个寡核苷酸5’端带有一个配基。连接后，通过固相化的亲和配基使其固定，漂洗后，检测另一寡核苷酸3’端携带的适当标记分子。这一过程如重复进行多个循环，则连接产物会呈线性增加，故称这循环进行的OLA为连接检测反应（LDR）。此反应中若再加入两种与上述寡核苷酸互补的寡核苷酸互补的寡核苷酸进行循环的连接反应，则称之为连接酶链反应。两寡核苷酸在无靶序列的情况下，在非常接近的位置发生杂交的可能性极小，因此，OLA技术的假阳性极少。另外，连接酶所形成的键是连接产物。该法适于简单、标准化的基因组样品处理法，或直接用表面活性剂和蛋 白酶初步处理有核细胞作为检测样品。
打点杂交 　　当扩增产物是多条带时，用点杂交更合适。这种方法的基本过 程是，首先将扩增的DNA固定到尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再 用放射性或非放射性标记的探针杂交。点杂交还有助于检测突变 DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分型。放射性同 位素32 P标记的寡核苷酸探针检测的敏感性、特异性和方法的可靠性均不容怀疑，对人们认识某些疾病与基因变异的关系起了很大的作 用。但是，由于同位素不稳定和放射性危害，不能常规用于临床或法医检验。因而用非放射性物质（生物素、和地高辛等）标记的寡 核苷酸探针分析PCR产物以确定核酸序列变异则是一种简便而安全的方法。非放射性标记物质稳定性高、使用方便、安全、检测速度 快。
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viviannea

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