简单序列重复区间PCR

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                        一、引言
在真核生物基因组中均存在着由1~4个碱基对组成的简单重复序列(simple sequence re-peats,SSR),又称之为微卫星(microsatellite),如(GA)。、(ACn、(GAA)n等。同一类微卫星DNA可分布在整个基因组不同位置上,由于其重复次数不同或重复程度不完全而形成每个座位的多态性。SSR两端有一段保守的DNA序列,通过这段序列可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物,对SSR进行PCR扩增,由于SSR多态性仅由简单序列的重复次数的差异引起的,通常表现为共显性。ISSR(inter-simple sequencerepeats)是一种新型的分子标记,是于1994年创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。它的生物学基础仍然是基因组中存在的SSR。ISSR标记根据植物广泛存在SSR的特点,利用在植物基因组中常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于ISSR-PCR扩增的引物通常为16~18个碱基序列,由1~4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA中SSR的5或3'末端结合,导至位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组片段被PCR扩增。SSR在真核生物中的分布是非常普遍的,并且进化变异速度非常快,因而锚定引物的ISSR-PCR可以检测基因组许多位点的差异。有时为了增加多态性,常常采用一个SSR序列和一个随机引物组成的引物对,这样就又获得了另一种与SSR相关的标记,这种标记一端可以锚定在SSR序列中,另一端则可以通过随机引物来筛选,同一个SSR序列引物与不同的随机引物组合,可以获得各种各样的组合,从而得到更多的多态性。ISSR(inter-simple sequence repeat)是在SSR的基础上发展起来的,与 SSR-PCR相比, ISSRPCR引物设计更为简单,应用更为方便。
二、原理
ISSR是一种以PCR技术为基础的分子标记,由ZietkiewiczE等于1994年首次提出2,其基本原理就是在SSR的3′或5′端加锚1~4个嘌呤或嘧啶碱基,然后以此为引物,对两侧具有反向排列SSR之间的一段DNA序列进行扩增(见图11-2),而不是扩增SSR本身,然后进行电泳、染色,根据谱带的有无及相对位置,来分析不同样品间SSR标记的多态性。它在引物设计上比SSR技术简单得多,不需知道DNA序列,即可用引物进行扩增。ISSR技术的原理和操作与SSR、RAPD非常相似,但其产物多态性远比RFLP、SSR、RAPD更加丰富,可以提供更多的关于基因组的信息;由于其退火温度相对来说较高(≥52),试验重复性也更好。



三、材料
模板:基因组DNA。
dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L。
引物:浓度为10mol/L。
TaqdnA聚合酶。
10×PCR缓冲液。
高压灭菌去离子水。
用于琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳的试剂,
PCR扩增仪。
四、方法
1.引物设计
引物设计是ISSR技术中最关键、最重要的一步。基因组中的SSR一般为2~6个寡聚核苷酸,用于ISSR的引物常为5′或3′端加锚的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列,重复次数(n)一般为4~8次,使引物的总长度达到20bp左右。5'或3端用于锚定的碱基数目一般为1~4个,锚定的目的是引起特定位点退火,使引物与相匹配SSR的一端结合,而不是中间,从而对基因组中特定片段进行扩增、检测基因组中,发现最多的SSR是二核苷酸重复序列,如(AT)、(TA)、(CA)n等,因此,ISSR技术中所用的引物以加锚的二核苷酸重复序列为主,寡聚三核苷酸、四核苷酸用得比较少。
一般来说,ISSR引物为通用引物,不像SSR引物那样需要根据物种基因特征合成引物。大多数引物是在3端加锚,加锚的位置直接影响到扩增结果,Moreno等在葡萄、Blair等在水稻中发现,5′端加3个碱基锚定的引物产生较多的带纹,而3′端加锚的引物产生较少的带纹。
通常研究者使用一种引物,如图112所示的5(CA),NN3’,但也有研究者应用一对不同的引物,如(CA)n+(AC)、(TG)n+(GT),等,这些引物不仅能扩增出单引物所产生的全部带纹,而且常有新的DNA片段被扩增出来。
2.模板
一般使用经过试剂盒提取的基因组DNA。
3.操作方法
(1)设立50l的PCR反应体系在0.25ml的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液                     5μl  DNA模板      5ul(5-50mg)
2.5mmol/L的dNTP混合液        各1ul  Taq dna聚合酶(5U/ul)   0.5ul
10mol/L的正、反向引物           各1ul        H2O        至50μl
如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50μl)。将PCR试管放入到PCR仪上。
(2)设置PCR反应条件
预变性     94,3min
变性        94,30s
退火        52,30s
延伸       72,2min
（变性、退火、延伸30个循环）
延伸        72,7min
PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000bp左右。
需要做预实验,对变性温度、复性温度、热循环程序进行优化,以获得清晰、可重复、易统计的带纹。
(3)PCR产物的检测和分析PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。目前DNA分离中所用的电泳介质都可用于ISR扩增产物的分离,琼脂糖浓度常用1.5%~2.0%,聚丙烯酰胺常用浓度为6%,后者的分离效果通常会更好。用硝酸银或溴化乙锭(EB)染色后,在可见光(银染)或紫外光(EB染色)下进行观察,统计带纹的有或无及相对位置,然后根据研究目的,应用相关软件进行分析。
五、注意事项
由于ISSR技术也是基于PCR的一种标记,所以如同RAPD标记一样,其反应条件易受各种因素的干扰,如模板DNA、TaqDNA聚合酶、dNTP以及Mg2的浓度等都能影响IsSR的结果。若许多因子的条件不适合,则会导至图谱弥散状背景的产生、扩增产物的消失以及电泳谱带位置的改变。这些现象都影响ISSR的扩增结果,从而影响整个实验的结果。要注意的问题如下。
要保证DNA模板的质量,DNA模板的质量及数量直接影响到PCR效果。
不同引物的退火温度应根据引物的T值要略有变动。ISSR引物的长度一般都在15-24bp,反应的退火温度52~55,比RAPD的36~40高,ISSR-PCR反应的敏感性低于RAPD;ISSR引物含有一定长度的重复序列,与它结合的目标序列在DNA复制的过程中存在滑动和不均等交换现象,使得它们在不同品种或个体间的重复次数存在较大差异,更易于导至引物结合位点和两结合位点间的片段长度产生差异。
ISSR-PCR扩增的带型背景较强时,可在PCR反应体系中增加一些化学物质,使背景颜色减弱,条带清晰。在ISSR反应体系中加入2%甲酰胺能够降低由于引物滑动而引起的背景模糊,加入2%~4%DMSO能提高反应的特异性。
六、应用
ISSR技术由于引物较长、退火温度较高,增强了实验的可重复性,同时实验操作简单、快速、高效,而且ISR标记还可以揭示整个基因组的一些特征,并呈孟德尔式遗传,因此该技术问世,就在遗传分析中得到广泛应用,尤其是在植物遗传分析中。ISSR标记一般是显性遗传的口,这在谱带统计和遗传分析中需引起注意。
1.遗传作图与基因定位
遗传作图研究的目的是寻求足够的多态分子标记,从而将所有基因定位到特定染色体的特定区域。Kojima等首先将ISR标记用于小麦遗传作图,目前已有桃、大麦0、柑橘等[1利用ISSR标记进行遗传作图。Ammiraju等)利用ISR技术找到了与小麦籽QIL连锁的分子标记,
3个标记与小种子性状连锁,4个标记与大种子性状连锁
2.亲缘关系和遗传多样性的研究
基因型不同的品种,或不同亲缘关系的物种,基因组内核苷酸序列存在差异,当使用同一ISSR引物对不同基因组体外扩增时,基因组上与引物互补的DNA片段(模板)的数目、位点是不同的,因而其扩增产物的大小、数目也不同,亦即扩增产物表现出多态性。当使用一系列不同的ISSR引物扩增时,这种多态性更加丰富。这种扩增产物的多态性反映了被测材料的遗传多样性。刘晓静等利用正交设计L16(45)和单因素试验对益智ISSR-PCR反应体系的5因素(Tag酶、Mg2、模板DNA、dNTPs、引物)在4个水平上进行优化试验,这一优化系统的建立为利用ISSR标记技术研究分析益智遗传多样性奠定基础。江树业等以光敏核不育水稻农恳58S及其原始株农垦58核DNA为模板,进行了ISSR多态性分析。结果表明,在可扩增的78个ISSR引物中,7个ISSR引物的扩增产物表现出DNA多态性。
进一步通过ISSR标记与其它遗传分析手段,还可以对不同亲缘物种间的分类、遗传距离、系统发育、亲缘关系等进行研究。blair等在水稻研究中得出的遗传差异表明,ISSR标记可以在亲缘关系较近的品种间检测遗传差异,评估不同品种间的异质性。
3.分子标记辅助育种
植物育种中分子标记辅助选择是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标基因是否存在。通过ISR分析可筛选出与目标基因(性状)紧密连锁的DNA片段,作为辅助育种的分子标记。利用分子标记不仅可以定位目标基因,也可利用与目标基因紧密连锁的分子标记追踪目标基因。应用这些分子标记进行间接选择,将得到事半功倍的作用。目前利用ISSR筛选出的目标基因有镰孢菌抗性基因等。
七、小结
综上所述,ISR技术尽管存在一些缺点,使其应用受到限制,但它稳定、方便、快捷以及多态性丰富等优点却是其它分子遗传标记无法比拟的。随着分子技术的发展,相信ISR技术的缺陷或被克服,或通过其它途径得以完善,从而使其成为一种成熟的遗传分析手段而更适合于推广应用。

原文地址：简单序列重复区间PCR -李林的博客