IVD知识文库系列-11.4微生物知识の细菌育种

纳兰烙烙

编者按：

本次章节依旧是微生物篇章的基础性文章分享，主要分享了细菌遗传研究延伸而来的细菌育种概念。

包含了：育种的经历、挑选育种、设计方案、变异株的挑选、菌种的衰退与复壮、菌种的保藏、菌种保存机构。

关键词：诱变育种、设计方案、菌种复壮、菌种保存、保存机构。

其意义在于了解微生物中关于细菌菌种保存与复壮的概念。

细菌育种的概念

节选《微生物的遗传变异和育种》

细菌育种的概念

微生物育种的目的是人为地使某种代谢产物过量积累，最大程度降低成本，把生物合成的途径朝人们所希望的方向引导，最终获得高产、优质和低耗的菌种。

细菌育种的大致经历

从生产中选育或定向培育选育（未采用诱变剂，自发突变株）——采用诱变剂进行诱变，提高突变频率，筛选有用菌株——利用接合、原生质体融合等技术使基因发生重组（细胞水平）——体外DNA重组技术（基因工程技术）创造具有新的生物性状的生物。

细菌育种及挑选

1.自身突变与育种

主要是通过实践经验选择生产中发生自发突变的菌株或不断转接微生物菌株以期获得其自发突变菌株。

生产中选育

例：宇佐美曲霉-上酒白种。

定向培育

例：卡介苗的筛选，连续接种230代

特点：费时、费力，工作被动，守株待兔式的，效果难以确定。

2.诱变育种

指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。

诱变育种的意义

应用方面，可获得各种突变菌株；

生产方面，既能大幅度提高有用代谢产物的产量，又能达到减少杂质、提高质量、扩大品种和简化工艺的目的；

方法方面，具有简便易行、条件设备要求低等优点。

细菌育种的环节

1、诱变育种的基本环节

2、诱变育种的原则

Ames试验：

利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用。

“生物化学统一性”法则：

人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。

诱变剂的共性原则：

化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比。超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。

选出优良菌种：

来自生产中的自发突变菌株；具有有利于进一步研究或应用性状的菌株；已发生其他突变的菌株；对诱变剂敏感性较高的增变变异株。

处理单细胞或单孢子悬浮液

不纯菌落: 多核、dsDNA 表型延迟

表型延迟：遗传型虽已改变，但表型却要经染色体复制、分离和细胞分开才表现出来的现象。

细菌一般以对数期为最好；霉菌或者放线菌的孢子稍加萌发后再进行诱变可以提高诱变率。无菌的玻璃珠打碎成团的细胞，再用脱脂棉过滤。诱变后的不纯菌落可用适当的纯种分离方法加以分离纯化。

使用最佳诱变剂量

剂量 = 强度（浓度）× 作用时间

相对剂量 = 杀菌率

在产量性状的诱变育种中，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变方向的剂量，就是合适的剂量。

两条重要的试验曲线：

剂量存活率曲线

剂量诱变率曲线

研究发现正突变较多地出现在偏低的剂量中，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。在用紫外线做诱变剂时，倾向采用相对杀菌率为70% - 75%的剂量。

充分利用复合处理的协同效应

两种或多种诱变剂先后使用；

同一诱变剂的重复使用；

两种或多种诱变剂的同时使用。

寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标

设计高效率筛选方案

初筛：选取较多有生产潜力的菌株；

复筛：对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定

根据具体情况创造新型筛选方案

对产量突变株生产性能的测定方法:

初筛：以粗测为主，摇瓶或者平板培养

平板培养：快速、简便、直观，但其培养条件不一定与摇瓶和发酵罐的条件一致。

复筛：对产量突变株作生产性能的精确测定摇瓶或者发酵罐。

突变株的筛选

（1）产量突变株的筛选

（2）抗药性突变株的筛选

梯度平板法：是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。

（3）营养缺陷型突变株的筛选

基本培养基（MM）: 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的组合培养基；

完全培养基（CM）：可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。

补充培养基（SM）：只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基。

菌种的衰退与复壮

性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。影响微生物菌种稳定性的因素：

a）变异；

b）污染；

c）死亡。

衰退：菌种出现或表现出负变性状

原有形态性状变得不典型；

生长速度变慢，孢子变少；

代谢产物生产能力下降；

致病菌对宿主侵染力下降；

对外界不良条件的抵抗能力下降等。

菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变，一个量变到质变的逐步演化过程。

菌种的复壮（rejuvenation）：

狭义的复壮：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到回复该菌原有典型性状的一种措施。

广义的复壮：在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。

（一）防止衰退的措施

1）减少传代次数；

2）创造良好的培养条件；

3）利用单核体传代；

4）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；

5）采用有效的菌种保藏方法；

（二）菌种的复壮：

1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。

a）纯种分离；

b）通过寄主体进行复壮；

c）淘汰已衰退的个体。

菌种的保藏

菌种保藏：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱，以供研究、生产、交换之用。

基本原则：

1、挑选典型菌种的优良纯种；

2、尽量使用分生孢子、芽孢等休眠体；

3、创造有利于休眠的保藏环境（如干燥、低温）；

4、尽可能多的采用不同的手段保藏一些比较重要的微生物菌株。

菌种的保藏机构

一、国内

1978年7月，中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM）在北京成立。

下设六个全国性菌种保藏管理中心

1. 普通微生物菌种保藏管理中心

中科院微生物研究所：细菌、真菌

中科院武汉病毒研究所：病毒

2. 农业微生物菌种保藏管理中心

中国农科院

3. 工业微生物菌种保藏管理中心

轻工部食品发酵工业科学研究所

4. 医学微生物菌种保藏管理中心

卫生部药品生物检定所：细菌

中国医学科学院皮肤病研究所：真菌

中国医学科学院病毒研究所：病毒

5. 抗生素菌种保藏管理中心

国家医药总局四川抗生素研究所：新抗生素菌种

华北制药厂抗生素研究所：生产用抗生素菌种

6. 兽医微生物菌种保藏管理中心

农业部兽医药品监察所

二、国外

世界菌种保藏联合会（WFCC）

美国典型菌种收藏馆（ATCC）

美国农业研究服务处菌种收藏馆（ARS）

荷兰真菌中心保藏所（CBS）

英国国立典型菌种收藏馆（NCTC）

英联邦真菌研究所（CMI）

英国国立工业细菌收藏所（NCIB）

日本微生物菌种保藏联合会（JFCC）

日本东京大学应用微生物研究所（TAM）

日本大阪发酵研究所（IFO）

西德发酵工业研究所微生物收藏馆（MIC）

小编将在本章节带来微生物篇章的立体全方位的内容分享，包括了微生物的分类、检测方法、涉及厂家、市场常见的检测产品等知识。

来源：小桔灯网  作者：纳兰烙烙

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