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[讨论] PCT抗体偶联技术讨论

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发表于 2018-3-14 15:51 | 显示全部楼层 |阅读模式

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2018.3.1温度:2.16℃湿度:60%
材料:
JSR胶乳微球,粒径240nm,用量(10mg)
PCT抗体,用量0.8mg
微球:抗体=10:0.8
活化液:50mM浓度MES,PH6.0
包被液:50mM浓度PBS,PH7.0
储存液:100mM浓度PBS,PH7.4,0.5%BSA,5%甘油,0.1%NaN3,8.76g/L氯化钠。
步骤:
一、偶联剂配制:0.2mgEDC、0.2mgNHS分别溶解于0.5ml MES中,现配现用。
二、活化:用MES稀释微球至0.5ml,微球w/v为2%,加入0.5mlEDC,再加入0.5mlNHS,室温搅拌反应30min,13000rmp/min离心5min,沉淀用1.5mlPBS重悬,50%  功率超声1min。
三、包被:用PBS稀释抗体至1.5ml,把抗体快速加入到活化后的微球中,室温搅拌反应3小时,加入2mg/ml BSA 1ml封闭反应1小时。
四、储存:13000rmp/min离心30分钟,沉淀用包被夜清洗两次,用5ml储存液重悬,50%功率超声5min,3000rmp/min离心15min,去除沉淀,2-8度保存。

4%PEG6000为R1,参数5:200:50,测试100ng/ml的PCT反应度才0.1左右,哪位高手帮分析一下,问题在哪里???




楼主热帖
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发表于 2018-3-15 10:08 | 显示全部楼层
我准备做但还没开始,想问问楼主胶乳微球是什么材料(聚苯乙烯粒子吗?);另外看了些资料,貌似尽量都用MES缓冲液,楼主中间包被的时候为什么要换成PBS呢?不知最后抗体和胶乳微球偶联效果如何,如果偶联效率低信号弱就很正常。具体怎么优化我没有方案,不过有个思路建议:楼主可以做几种不同的标记方案,最好区别大一点,最后再来看实验结果,这样去快速找到主要的影响因素然后做针对性的优化。
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 楼主| 发表于 2018-3-16 11:48 | 显示全部楼层
使用的微球就是聚苯乙烯羧基微球,其实MES盒PBS效果都差不多,主要在于活化和包被缓冲液的浓度和PH。
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发表于 2018-3-16 13:32 | 显示全部楼层
小金黎 发表于 2018-3-16
使用的微球就是聚苯乙烯羧基微球,其实MES盒PBS效果都差不多,主要在于活化和包被缓冲液的浓度和PH。

超声的时间是不是太长了点;另外抗体抗原的匹配效果也是要考虑的
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 楼主| 发表于 2018-3-16 14:37 | 显示全部楼层
我5ml的量,65%的功率超声5分钟,你觉得长了吗?抗原抗体匹配性问题应该不大。
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发表于 2018-5-9 12:31 | 显示全部楼层
10mg的胶乳在1.5mL的体系里进行活化?活化不充分,导至包被抗体不到位。
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发表于 2021-1-27 14:05 | 显示全部楼层
抗体是否匹配?还有就是优化偶联缓冲体系
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发表于 2021-6-23 10:28 | 显示全部楼层
许多时候你内心在挣扎与彷徨,其实就是要么你没有意识到幸运飞艇某些方面是不对的,要么就是你错误的超级大乐透意识到某些方面是对的。在不知不觉间你就掉入了一个环,自己在错误的十一运夺金思想闭环里生活了很久,也许一年,也许很多年。

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