78家实验室满分！全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质评结果发布

纳兰烙烙

基因/临床研究

2017年10月27日，卫生部临床检验中心（NCCL）公布《2017 年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质量评价（又称能力验证）》结果的总结。

全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价计划，是保证各临床实验室检测质量的重要手段。可以确定参评实验室肿瘤体细胞突变高通量测序检测的能力；发现在检测中存在的共性问题以及某些实验室存在的特殊问题，促进实验室提高检测水平。

2017年度，能力验证共有来自18个省（市、自治区）的共102个实验室参加肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质评活动。本次有91个实验室回报了结果。

预期结果：本次室间质量评价共检测6份样品，预期结果见下表

表： 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质量评价预期结果

评价原则：

1. 假阴性结果：在检测范围、检测限以上的基因突变均要求正确报告，未报告即为假阴性结果。一个假阴性结果，扣除20分。

2. 假阳性结果：预期结果以外的基因突变结果报告，均为假阳性结果。一个假阳性结果，扣除10分。

3. 错误结果的报告：实验室报告了预期结果内的基因突变，但存在以下错误情况：

A.突变位置相差1个碱基； B.1个碱基识别错误; C.其它。

错误A和B每个扣除5分。错误C每个扣除10分。

4. 填写不完整：例如，未写明氨基酸等。每个扣除5分。

5. PT成绩计算：所有错误结果累计扣分，满分100分。

得分大于等于90分则为合格；PT成绩小于90分为不合格。

PT成绩合格的实验室，融合基因需全部检测正确，融合基因检测成绩方为合格；否则仅点突变、短片段缺失和插入检测成绩合格。

本次质评中，实验室PT成绩情况如下：

至目前为止，我国已经开展了三次肿瘤体细胞突变高通量测序室间质量评价，分别为：2015年肿瘤体细胞突变高通量测序室间质量评价调查（合格率为51.2%，37/72；100%正确的实验室为16.7%，12/72），2017年第一次全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价（合格率为52.3%，48/92；100%正确的实验室为45.7%，42/92），2017年第二次全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价（合格率为89.0%，81/91；100%正确的实验室为85.7%，78/91）。可以看出，高通量测序实验室的检测成绩有了逐步地提高，假阴性和假阳性结果明显减少。本次假阴性结果主要来源于ERBB2缺失突变，以及PIK3CA c.1633G>A (p.Glu545Lys)和PIK3CA c.3140A>G (p.His1047Arg) 的漏检。出现错误的实验室应分析并查找原因。

室间质量评价不仅考核实验室的检测能力，同时也是对实验室检测标准化和规范化的教育过程。目前肿瘤体细胞突变高通量测序检测全部为实验室自建试剂方法（laboratory-developed tests, LDTs）。使用LDTs试剂的实验室需要首先建立试剂配制和使用的标准操作程序。NGS检测通常包括核酸提取、片段化、文库制备、加入标签、混样、测序、生物信息学分析和结果报告等步骤，NGS实验室会购买核酸提取试剂盒、文库制备试剂盒、通用测序反应试剂盒等，或者自行设计富集区域，合成相应的引物探针等，并且建立生物信息分析的流程；那么实验室相当于自行制备了一个试剂盒，因此对试剂盒中所有试剂原料的来源、试剂配制的过程、基因检测的区域、生物信息分析的软件、版本、分析流程以及结果报告解释等均需详细说明。临床实验室需建立自己的质量标准，例如覆盖深度（Depth of Coverage）、覆盖均一性（Uniformity of Coverage）、碱基识别质量值（Base Call Quality Scores）、比对质量值（Mapping Quality）等，并在每一批的检测过程中始终监测并记录，规定可接受的和不可接受的质量标准的值，不符合质量标准的结果为检测失败，同时建立检测失败的进一步处理方法。因此，在肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价中，各临床实验室在填写“全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表”中检测范围、检测流程、生物信息分析流程和结果报告解释等的过程，同时也是实验室的对照、检查标准操作程序是否包含相应关键点的过程，即室间质量评价的教育内容。

昨日，2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评，以下为本次质评说明：

随着高通量测序技术的快速发展，高通量测序已由实验室研究逐步应用于临床，肿瘤基因突变的高通量测序对临床肿瘤患者的诊断、靶向治疗及预后判断具有重要指导意义。高通量测序检测过程可分为“实验室操作流程”（又称为“湿实验”）和“生物信息学分析流程”（又称为“干实验”）两个部分。“生物信息学分析”对于高通量测序检测结果的准确性与“实验操作”一样具有决定性意义。为了解我国肿瘤基因突变临床高通量测序实验室生物信息学分析能力的现状，卫生部临床检验中心（以下简称“临检中心”） 现开展该项目室间质量评价的预研。请各临床实验室使用日常所用程序进行分析。活动结束后，将向各参加实验室回报预期结果和质评小结，供实验室改善工作质量参考。并评价各参加实验室的检测成绩，发放相应证书。

一、活动流程

本次室间质评调查活动主要针对靶向测序数据的生物信息学分析。具体安排如下：

① 原始测序数据（FASTQ或BAM格式文件）下载：2017年10月30日至11月2日17:00（下载地址于10月30日8:00通过ncclmys公众号发布）。

② 靶向区域bed文件下载：2017年11月1日（下载地址于11月1日8:00通过ncclmys公众号发布）。

③ 结果回报：2017年11月3日17点前。注意：为保证及时回报结果,截止日期后收到的结果将不予统计分析。

④ 临检中心公布质评预期结果，各实验室根据预期结果核对分析错误原因并上报临检中心：时间待定。

⑤ 临检中心发布质评小结和相应证书：时间待定。

请各实验室关注临检中心临床免疫室微信公众号：ncclmys，后续通知将会通过ncclmys公众号发布，请及时查看。

二、样本信息

1.本次室间质评样本数据文件分三个测序平台：

①Illumina测序文件：Illumina HiSeq2500高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为FASTQ格式。使用的靶向测序panel为定制探针杂交捕获panel，靶向区域BED文件：Illumina_target.bed。

②Ion Torrent测序文件：Ion Torrent PGM高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为BAM格式。使用的靶向测序panel为Oncomine Comprehensive Assay 扩增子捕获panel；靶向区域BED文件：OCP_target.bed。

③ BGI-Seq500测序文件：BGI-Seq500高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为FASTQ格式。使用的靶向测序panel为定制探针杂交捕获panel，靶向区域BED文件：BGI_target.bed。

2. 各平台B1701~B1704号样本为肿瘤组织DNA高通量测序数据；B17NC 号样本代表临床上来自同一患者外周血或者正常组织样本中提取的基因组DNA样本数据。其中样本B1702-1704均提供临床信息，请根据提供的临床信息对B1702-1704号样本进行检测，并给出临床基因检测解读报告。

3. 具体样本信息见附件1。

三、样本处理方法

1．样本的发放：

为保证本次质评顺利开展，临检中心开通了2种数据传输方式（百度云盘和FTP客户端），希望各单位选择合适的下载方式，分流下载。

样本数据下载完成后请各实验室检查各样本编号及数量是否与活动安排相符并进行md5校验，如发现问题请立即与临检中心联系。

请各参加单位根据各自的报名情况自行选择不同测序平台数据下载，如报名参加多个测序平台的数据分析，请根据测序平台分别上报结果。

2．样本检测要求：

（1）根据上述提供的高通量测序数据，各实验室按照要求分别针对各测序平台对所接收的B1701~B1704号样本中肿瘤组织体细胞突变(somatic mutation)进行分析鉴定。注意：本次质评需根据中心提供的靶向测序panel中包含的基因范围（见BED文件）进行回报，即检测出测序panel中包含的所有体细胞突变(somatic mutation)；不接受实验室自定检测范围。

（2）本次质评样本可能包含的突变类型为单核苷酸变异（SNV），小的插入和缺失（Indel），拷贝数变异（CNV）以及基因重排（Rearrangement）即结构变异（SV）。各实验室需根据各自分析能力选择所分析的变异类型。

（3）因测序仪器及实验操作存在不同程度的背景噪音，因此本次质评需按照以下要求进行分析：

① Illumina测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 1%且测序深度（Read depth）> 500X的位点进行回报。

② Ion torrent测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 5%且测序深度（Read depth）> 500X的位点进行回报。

③ BGISeq500测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 1%且测序深度（Read depth）> 500X的位点进行回报。

四、结果回报

1. 电子邮箱：请登录 ncclmys2012@163.com，密码：nccl123456 下载“2017年全国肿瘤体细胞基因突变检测生物信息分析室间质量评价结果回报表”的电子版，填写完整后，发送至ncclmys@163.com。

2．本次室间质评调查活动中的专业问题可与临床免疫室联系：

电话：（010）58115053

联系人：张瑞，李金明

卫生部临床检验中心

2017 年 10月

来源：卫生部临床检验中心

来源：基因谷