学术前沿 | cfDNA用于肿瘤诊断的检测策略

纳兰烙烙

今天介绍一篇关于利用cfDNA进行肿瘤分子诊断相关方法介绍的综述A field guide for cancer diagnostics using cell-free DNA: From principles to practice and clinical applications，本文从cfDNA的性质、提取方法、突变检测方法、优缺点及应用潜力等方面进行了详细介绍。

综述结构如下：

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1、 CELL-FREE CIRCU LATING DNA AND THE SUBPOPULATION OF CTDNA

2、 CFDNA EXTRACTION FROM BLOOD AND OTHER MATERIALS

3、 METHODS TO ACCURATELY MEASURE THE QUANTITY OF CFDNA

4、 TEST PARAMETERS AND KEY DETERMINANTS OF SENSITIVITY IN LIQUID BIOPSY DIAGNOSTICS

5、 DIFFERENT METHODS FOR MUTATION DETECTION IN ROUTINE DIAGNOSTICS

• Sanger sequencing
• Quantitative PCR
• dPCR and ddPCR
• NGS or massive parallel sequencing
• Whole-Exome Sequencing or Whole-Genome Sequencing
  
  

6、 DETECTION LIMITS IN CFDNA: HOW LOW CAN WE GO?

7、 LIQUID BIOPSY FOR MUTATION TESTING IN DIFFERENT DIAGNOSTIC SETTINGS

• Upfront testing for mutations: Can liquid biopsy identify cancer patients de novo?
• Primary testing for targeted therapies using liquid biopsy
• Longitudinal testing: Tracking tumors during therapy
• Testing for resistance to treatment variants: Second line therapies
  
  

8、 LIQUID BIOPSY IN DIAGNOSTIC REPORTING: WHAT INFORMATION IS IMPORTANT FOR THE ONCOLOGIST?

9、 FUTURE APPLICATIONS OF LIQUID BIOPSIES IN INDIVIDUALIZED THERAPY

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1948年Mandel和Metais在人类血液样本中发现了cfDNA，之后人们又发现肿瘤患者的cfDNA含量远高于健康人群，这些cfDNA存在于人体的大循环中（如下图所示），也在膀胱癌、结直肠癌和非小细胞肺癌患者的尿液中有发现，另外在粪便、唾液、脑脊髓液及胸腔积液中都观察到了cfDNA存在的证据。

虽然对于cfDNA的发现和关注越来越多，但是关于cfDNA的起源和释放机制，仍然没有完全透彻的被理解，目前cfDNA来源的假设主要有来自细胞凋亡、裂解以及外泌体的释放，因此我们可以利用cfDNA的检测来进行肿瘤诊断。在肿瘤患者的血液中ctDNA含量可以从<0.001%到高于60%，当然这与肿瘤体积以及肿瘤发展阶段是相关的（图B）。

为了临床诊断的需求，我们需要从不同组织中提取出cfDNA，目前市场上已经有很多用于cfDNA提取的商业性试剂盒，但效果差异较大。文章提到了对cfDNA提取效果的研究，有56个不同的实验室参与了对同一个标准血浆样本的提取，但结果得到的cfDNA含量差异较大，从2.87ng/ml到224.02ng/ml，平均23.15ng/ml。由于cfDNA的含量会大大影响突变检测的灵敏度，因此对于cfDNA的分离和富集非常重要。此外cfDNA在不断的释放同时也在不断被清除，血液中DNA半衰期大约是2小时，对于临床样本如何快速有效的提取cfDNA是目前需要突破的一个问题。

接下来，文章提到对于突变检测的标准，我们需要关注1)、检测的准确性和精确性，2)、结果的稳健性，3)、灵敏度以及检测特异性。文章提到目前已经发表的报道中，对于检测到的突变频率阈值从1%到0.001%都有，这些方法包括dPCR、BEAMing以及CAPP-seq等。不过上述这些能检测到的极低频率依旧依赖于提取到的cfDNA含量，例如我们要检测一个0.001%（即100,000中有1个）频率的杂合突变，在这个位点至少需要100,000个覆盖，正常人类单个细胞约有6.6pg基因组，就需要660ng的cfDNA才能达到0.001%，如果需要大于1个覆盖度来排除假阳性的话，那么挑战就更大了。

目前用于肿瘤诊断的突变检测方法有桑格测序、定量PCR、dPCR和ddPCR以及NGS。对于NGS在常规诊断中要达到高灵敏度的检测，目前较为实用的方法是分子标签加上iDES去除背景错误，可检测到频率0.1%的突变。

和组织相比较，cfDNA的检测更加方便、快速，但由于目前的NGS实验及检测方法的局限性，组织活检依旧是金标准。

Reference：

Volckmar, A.-L. et al. A field guide for cancer diagnostics using cell-free DNA: From principles to practice and clinical applications. Genes, Chromosom. Cancer 57, 123–139 (2018).

来源：誉衡基因