尿液PCA3基因检测在前列腺癌诊断中的意义！！！

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尿液PCA3基因检测在前列腺癌诊断中的意义

【关键词】  DD3基因；RT-PCR；前列腺癌；尿液

　近年来临床上前列腺癌的患者明显增多，其诊断指标有血清PSA和前列腺穿刺活检，由于临床上影响PSA升高的因素很多，临床假阳性的概率高；其穿刺活检是一种有创性检查，感染和出血的机会大，所以有必要用一种更特异的检测方法来诊断前列腺癌。PCA3是近几年来所发现的一种最佳的前列腺癌特异基因，其表达仅在前列腺上皮细胞，且具有肿瘤特异性。本实验建立在RT-PCR基础上检测尿液中PCA3基因表达情况，以探讨其在前列腺癌诊断中临床意义。
     
1  资料和方法   
1.1  一般资料  
　　本院2008—04～2009—08门诊和住院病人中经穿刺活检和术后病理证实为前列腺癌的病人20例，前列腺增生组中病人30例。
     
1.2  主要试剂和仪器   
Trizol，TaqMan Reverse Transcription Reagents ，Rnase抑制剂，Taq DNA聚合酶，50bp和100bpMarker ，琼脂糖，PCR仪，PCR电泳仪，高速台式冷冻离心机TGL-16M，YLN-2000型凝胶影像分析系统，GIS凝胶图像处理系统，电子恒温水浴锅，FA 2004型电子分析天平，微量移液器，低温冰箱。
     
1.3  标本的收集和总RNA的提取   
　　（1）取前列腺按摩后的第一次尿液30mL，立即放入冰中冷却。于3000rpm/10min离心收集尿沉渣，加等量冷D-hanks液洗涤两次，放置在-70℃保存备用，按经典总RNA抽屉试剂盒说明书上提取总RNA后真空干燥。用15mL DEPC溶解,取2μL RNA溶液加入98μL水中,混匀后在微量分光光度计上测A260/A280比值及RNA含量。
     
1.4   RT-PCR检测   
　　（1）cDNA合成：取11μL RNA模板样品，加入oligo180.5μg/μL，具体操作按逆转录试剂盒说明书进行，总反应体积约20μL，最后取2μL来PCR扩增，（2）PCA3的扩增：在外显子1和3之间设计一对PCA3引物，上游引物TGGGAAGGACCTGATGATACA'，下游引物，CCCAGGGATCTCTGTGCTT。   
1.5  统计学分析     
　　用SPASS12.0统计软件包对数据进行统计分析。数据分析用t检验。

2、结果   

2.1   尿液PCA3基因表达结果      
　　所有标本中均有PSA基因158bp电泳带，前列腺癌患者中见到一特异220bpPCA3电泳带（见图1），其中前列腺增生患者无PCA3基因表达。前列腺癌患者中都表达PCA3mRNA。

        

2.2  DD3mRNA在前列腺癌的诊断中敏感度较高
     
　　见表1。表1  PCA3mRNA阳性率和血清PSA浓度大小的关系  

3、讨论      

　　前列腺癌是西方国家男性是最常见的恶性肿瘤之一，位于死亡原因中的第2位。目前我国发病率呈上升趋势，前列腺癌诊断最常用的标记物之一是PSA及tPSA，前列腺穿刺活检是诊断前列腺癌的金标准，当血清PSA大于4ng/mL时，前列腺穿刺活检阳性率很低，所以临床上需要一种更特异的标记物来诊断前列腺癌［1］。PCA3基因是1999年bussemakers等［2］发现的一种前列腺癌特异基因，它是一种非编码RNA。该基因特异性表达与前列腺癌细胞，正常前列腺细胞，前列腺增生的细胞中不表达或者仅少量表达，在其他肿瘤组织中不表达。与PSA基因相比，PCA3基因是一个前列腺癌特异性很强的基因。本实验是建立在RT-PCR基础上，检测前列腺癌按摩后尿液中前列腺液PCA3基因的表达进行分析。由于不同标本中含有前列腺细胞数量不均，本实验选择PSA作为管家基因，已经证实PSA基因在正常前列腺细胞表达较恒定［3，4］。前本实验对前列腺按摩后尿液PCA3基因定性分析结果显示：前列腺癌患者尿液PCA3基因表达呈阳性，前列腺增生患者尿液PCA3基因表达为阴性，差异具有统计学意义（P<0.01）。以PSA的不同范围（小于4ng/mL，大于4ng/mL而小于10ng/mL，大于100ng/mL）将前列腺癌和良性前列腺增生患者分成4组，当PSA>10ng/mL时，两者的敏感性差异不大。当血清大于4ng/mL而小于10ng/mL时，PSA不能关鉴别前列腺癌和前列腺增生，tPSA的特异性也只有20%，也不能鉴别前列腺癌和前列腺增生［5］;该实验中PCA3基因阳性的有3例，这说明PSA值位于这一灰色区间时，PCA3基因敏感性高于PSA。本次实验在肛诊中发现一例患者前列腺有结节，其PSA<4ng/mL。尿液PCA3基因检测为阳性，这说明PCA3基因检测有可能发现这部份患者。

【参考文献】
  　［1］Reynolds MA,Kastury K, Grpskopf J,et al.Molecular markers for prostatecancer［Ｊ］.Cancer Lerr Feb，2007，249:5[CD*2〗13

　　［2］Bussemakers MJ,Van Bokhoven A,Verhaergh GW,et al.DD3：a new prostate-specificgene,highly overexpressed inprostate cancer［Ｊ］.CancerRes,1999,59：5975[CD*2〗5979

　　［3］Tinzl M,Marberger M,Horvath S,et al.DD3PCA3NRA analysis in urine-a newperspective for detecting prostate cancer［Ｊ］.Eur Urol，2004，46:182[CD*2〗186

　　［4］Groskopf J,Aubin SM,Deras IL,et al.APTIMA PCA3molecular urinetest:development of a method to aid in the diagnosis of prostate cancer［Ｊ］.Clin Chem，2006，52:1089[CD*2〗１０95

　　［5］Catalona WJ,Partin AW,Slawin KM,et al.Use of the percentage of freeprostate specific antigen to enhance differentiation of prostate caner frombenign prostatic disease;a prospective multicenter clinical［Ｊ］.JAMA，2007，279：1542+

来源：千麦医疗