数字PCR发展历程

纳兰烙烙

传统的荧光定量PCR，经过多年的发展，已是很成熟的实验方案了。其中，最常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在这二种方法当中，Taqman法又以其特异性高、定量精确，得到广大用户的认可。但是Taqman法PCR，它还是一个相对定量的办法。它测的是一个Ct值，也就是PCR到第几个循环，荧光强度达到了一个设定值。要想用Taqman方法得到：样本中到底有几个目标基因的拷贝，那么还是要再做一个标准品的（qPCR）曲线。才能知道样本的Ct值落在标准曲线的哪个位置上。再进一步推算出样本中的拷贝数量。这样做既增加了工作量，因为引入了标准品，又多引入了一个实验的误差变量。

新发明的微滴数字PCR采用一种全新的方式进行核酸分子的定量，与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确度、准确性和灵敏度更佳。定量的结果不再依赖于Ct值，直接给出靶序列的起始浓度，实现真正意义上的绝对定量。微滴数字PCR的原理，就是把原来一整管的PCR反应液，分散成几万个，甚至几百万个极微小的液滴。这些小微滴同时进行PCR反应，这样就可以计算出原来的反应液当中，有多少个目标基因的拷贝了。

随着数字PCR技术不断发展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品：

1、LIFE Technologies 3D数字PCR（芯片式数字PCR）：。在芯片上预制了2万个小孔，把PCR反应液，物理地注入到芯片上的小孔中，密封后，进行PCR反应，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。

2、Bio-Rad的微滴数字PCR（油包水原理）：实际上是QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术，该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，相继推出了QX100、QX200微滴式数字PCR系统，即将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，才有流式细胞术的原理，检测每一个液体，数阳性反应的液滴数量。

3、的数字PCR（油包水原理）、原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。价格从高到底：Raindance、Bio-Rad、LIFE Technologies。

ddPCR应用领域

(ddPCR) 系统可对DNA或RNA分子进行绝对定量分析，适用于 EvaGreen 或基于探针的数字PCR应用领域。包括：

（1） 癌症生物标志物研究和拷贝数变异分析

以卓越的灵敏度和准确度测量癌症突变的变异程度、检测稀有的 DNA 靶拷贝以及解析拷贝数变异状态。

（2） 病原体检测

精确地对靶 DNA 或 RNA 分子中的细微变化进行定量分析，从而检测和监测病原体。

（3） 与新一代测序 无缝对接

无需使用标准曲线，直接对 NGS 库执行绝对定量分析。

（4） 基因表达分析

可对少量 mRNA 和 miRNA 的细微变化进行准确及重复性极佳的检测。

（5） 环境监测，例如土壤和水。

（6） 食品检测，采用经过验证的 ddPCR 方法对转基因生物体 (GMO) 进行评估。

来源：品彬